张 娟,吴炜亮,谭嘉力,梁宇斌,李晓明

(广东产品质量监督检验研究院国家食品质量监督检验中心,广东佛山 528300)

植物源性转基因食品DNA提取技术的研究进展

张 娟,吴炜亮,谭嘉力,梁宇斌,李晓明

(广东产品质量监督检验研究院国家食品质量监督检验中心,广东佛山 528300)

如何从食品中提取到高质量和高纯度的植物基因组DNA是后续转基因检测成功与否的关键因素。通过对近年来国内外有关食品中植物基因组主要提取方法:CTAB法、SDS法、磁珠法、试剂盒法等进行介绍,分析各方法的优缺点,并展望其未来发展方向,以期为后续食品中植物基因组有效提取方法的建立提供借鉴。

食品,植物基因组,DNA提取

近年来,随着转基因食品品种的与日俱增,其安全性问题在世界范围内引起广泛关注。对此,各国都普遍要求对转基因食品进行标识,从而保护消费者的知情权和选择权。目前,植物源性转基因食品的检测技术主要是基于基因水平的,这就对前期的核酸提取技术和质量提出很高要求。由于转基因食品的组成成分比较多样,加工过程复杂,因此对DNA提取造成潜在的困难。基于此,国内外研究人员积极探索各种适合于转基因食品DNA的高效提取方法,本文就有关这方面的研究进展进行综述。

1 植物源性转基因食品DNA提取技术的研究背景

对植物源性食品进行转基因成分的检测,不论是最基础的PCR检测,还是后续更为复杂的分子生物学操作,前提条件就是从食品中获得能够满足分子生物学操作要求的高质量基因组DNA。虽然该技术在植物学研究领域属于成熟稳定的常规技术,但在食品特别是复杂食品领域并不完全适用。究其原因,主要来自两个方面:各种物理、化学及生物学加工处理方式对食品中的DNA造成不同程度的破坏和降解;食品生产加工过程中添加或自然产生的各种物质对DNA的提取造成不同程度的干扰。所以,长期以来食品中DNA提取技术成为制约基因检测技术在食品安全检测中进一步发展的重要因素。基于此,无论是从传统方法的改进还是新方法的开发方面都出现了许多新动向[1-4]。

2 植物源性转基因食品DNA提取技术

2.1 传统提取方法的改进

2.1.1 CTAB法 CTAB(hexadecyl trimethyl ammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子去污剂,能与核酸形成复合物。在低盐溶液(0.1～0.5mol/L NaCl)中,该复合物会因溶解度降低而沉淀,而大部分的蛋白质及多糖仍存在于溶液中,通过离心可将复合物与蛋白质及多糖等小分子物质分离;在高盐溶液(>0.7mol/L NaCl)中,该复合物可溶解并稳定存在,再用异丙醇/无水乙醇沉淀核酸,从而获得核酸提取物[5-6]。

CTAB法是经典的植物DNA提取方法,也是目前研究最多的用于提取转基因食品DNA的方法。国内外学者依据不同的食品类型,对CTAB法的各个环节进行针对性地优化,以达到提取高质量DNA的目的。周红霞等[7]为了提高食用油中DNA的沉淀效果加入核酸共沉淀剂和NaAc,经优化的CTAB法有效地提取到可用于PCR扩增反应的DNA模板。相比上述的方法优化,Sonia等[8]则从在裂解液中添加不同成分、裂解液组成成分浓度、裂解时间及沉淀时间等四个方面对CTAB法进行细致地优化,最终形成一种适合大多数植物油中DNA提取的方法。该方法相比其他传统方法耗时短、用油量少,且比商品化试剂盒价格更加优惠。Tung等[9]通过比较传统CTAB法和稍加改进的CTAB法(在裂解液中加入1%的巯基乙醇)提取未经加工的大豆和玉米中DNA的效果发现,传统CTAB法提取效果更好,DNA浓度分别达32.7ng/mg和28.4ng/mg,A260/A280吸光值比值均为1.9。Özge等[10]在运用PCR法检测转基因玉米和大豆的过程中,以CTAB法提取深加工产品中的DNA取得良好效果,后续PCR反应能扩增出对应目的条带。孙敏等[11]在使用CTAB法提取粉丝中DNA的过程中,加入猪肉DNA作为担体,实现微量核酸的共沉淀,该方法简单、实用,大大提高了核酸的提取效率,为转基因成分的检出奠定了良好的基础。此外,在裂解液中加入PVP(Polyvinylpyrrolidone,聚乙烯吡咯烷酮)也是CTAB法常用的改良方式。庄逸林等[12]通过在CTAB法提取过程中加入β-巯基乙醇和PVP来去除多糖和多酚类物质,实验证明该方法可用于新鲜番木瓜、番木瓜干和番木瓜果汁等经过简单加工产品的DNA提取。姚伟等[13]通过增加酚类物质的结合剂PVP和起抗氧化作用的亚硫酸钠,有效防止了多酚类物质的氧化。同时,PVP还可作为澄清剂吸附甘蔗叶中的多糖,使之沉淀去除。闫苗苗等[14]为解决植物易褐化的问题加入适量PVP以结合多酚类化合物。陈笑芸等[15]对转基因大豆深加工食品进行适当前处理后,利用改良CTAB法提取DNA,能显著提高大豆深加工食品中DNA的提取效率和质量。高媛等[16]为探求适宜转基因苹果种子DNA的提取方法,采用改良CTAB法、SDS法与高盐低pH SDS法对苹果种子进行提取方法比较。结果表明,改良CTAB法相比其他2种方法获得的DNA产量最高,可达0.221mg/g,更适于转基因苹果种子DNA提取。吴申懋等[17]以食品中常见的添加剂液体麦精和玉米糖浆为研究材料,采用改良CTAB法、SDS法和试剂盒法提取DNA。实验证明,改良CTAB法可得到较好质量的DNA,PCR扩增产物条带单一,可用以区分这两种添加剂。张秀杰等[18]预先用PBS缓冲液除去大部分的可溶性多糖,再通过提高CTAB缓冲液中NaCl浓度以去除残余多糖,成功从蜂蜜中提取到片段完整、纯度较高的DNA。而Sónia等[19]则为了追溯蜂蜜的植物源性,比较了5种不同的DNA提取方法,实验证明,在不考虑DNA产率的情况下,改良CTAB法和DNeasy Plant Mini试剂盒提取的DNA能获得比较理想的PCR扩增效果。同样地,Patrick等[20]以CTAB法为基础,通过改变几种加入成分和提取参数,建立一种从蜂蜜中自动提取DNA的方法。相比手动CTAB法,该方法获得更高产量的DNA,且不存在PCR抑制物。此前,该团队曾基于上述方法建立了从植物种子中自动提取DNA的方法,用于检测监督转基因植物[21]。

CTAB法虽然可以用于转基因食品中DNA的提取,但为了提高提取效率,往往需要针对样品实际情况进行反复的方法改良。此外,该法存在操作繁琐、耗时长、试剂组成复杂等问题,使其在使用上受到一定限制。

2.1.2 SDS法 与CTAB不同,SDS(Sodium dodecyl sulfate,十二烷基硫酸钠)是一种阴离子去污剂,在高温条件(55～65℃)下能裂解细胞,使染色体离析和蛋白质变性,同时与蛋白质和多糖结合成复合物,释放出核酸。通过提高盐浓度和降低温度,使该复合物沉淀出来,后用酚/氯仿反复抽提上清液中的核酸,以去除残余蛋白质,最后用乙醇沉淀DNA[5-6]。

SDS法也是提取植物基因组DNA的经典方法。Tigst等[22]用3种不同的DNA提取方法(试剂盒法、SDS法和高通量法)提取油菜、亚麻和大豆单个种子中的DNA,DNA平均产量达58～251ng/mg,均可满足后续检测需求。高媛等[16]为了探求适于转基因苹果果肉的DNA提取方法,采用改良CTAB法、SDS法和高盐低pH SDS法对苹果果肉进行基因组总DNA提取。结果表明,相比其他2种方法,SDS法在纯度和产量上效果最好,DNA的A260/A280值为1.808,产量为0.012mg/g。李葱葱等[23]以SDS为主要提取试剂,建立了用于玉米叶片基因组DNA的微量快速提取方法。该方法省略了抽提、洗涤等步骤,提取浓度可达250ng/μL以上,A260/A280的比值在1.9左右,纯度较高,满足了转基因成分定性PCR检测的需要。赵艳等[24]应用改良SDS法提取转基因稻米及经过蒸煮、微波膨化后稻米食品中的DNA,结果显示该法提取效果明显好于CTAB法,PCR技术能检测到加工食品中的转基因成分。许冬倩等[25]在SDS法提取油脂DNA的操作过程中,省略了酚/氯仿抽提的步骤,获得了满足下游PCR检测的DNA质量。推测其可能原因为油脂中干扰DNA提取的蛋白质及多糖类物质含量较低,酚/氯仿抽提的意义不太,相反,该步骤的增加伴随着DNA的损失。Hellebrand等[26]则利用SDS法从粗制油和精炼菜籽油中均提取到可用于PCR检测的DNA。梅玲玲等[27]采用CTAB法、酶裂解法及SDS法提取转基因食品中的DNA,综合DNA的提取纯度、浓度、PCR扩增效果及操作简易程度等因素,判定SDS法提取效果最好,具有经济、简便的特点,适用于PCR检测。毛国杰等[28]在SDS提取缓冲液中加入乙醇和PVP有效去除转基因番茄中的多糖和酚类物质,同时降低盐浓度以沉淀多糖,获得的DNA可进行稳定而准确的PCR检测,该方法克服了SDS法对含糖量高的样品提取效果不佳的缺陷。

SDS法操作简单、快捷,可获得符合检测要求的DNA。但是,由于SDS的主要作用是沉淀蛋白质,在去除多糖类物质方面不够理想,因此不适合提取含糖类较多的食品。

2.2 新提取方法的开发

2.2.1 磁珠法 磁珠法的基本原理是将细胞中游离出来的核酸分子吸附到磁珠表面,蛋白质等杂质不被吸附而留在溶液中。在磁场作用下,使磁珠与液体分离,回收磁珠,再用洗脱液洗脱磁珠,从而获得高纯度的DNA[5]。

磁珠法由于可以提取痕量DNA,而且提取的DNA纯度好、质量高,因此被广泛应用于多种复杂及深加工食品的DNA提取。王爱迪等[29]将磁珠法与市售试剂盒法进行比较,考察磁珠法对深加工食品中基因片段的提取效率。结果表明,磁珠法提取的DNA的完整性、浓度以及可扩增性等均超过试剂盒法。赵卫东等[30]制备了用于植物源性转基因食品中提取基因组DNA的磁性微球,并将其作为吸附剂进行DNA提取,结果表明,所提几种食品DNA的浓度和纯度较高,可满足后续检测需求。此外,该学者又以大豆和马铃薯植物源性食品为研究对象,比较了磁珠法、试剂盒法和CTAB法等5种方法提取DNA的效果,结果显示,与其他几种提取方法相比,磁珠法提取的DNA浓度稍低,但纯度较高,对于豆油和淀粉等深加工样品,可提取到很好的基因组片段,满足转基因检测的要求[31]。Catherine等[32]通过对比Wizard试剂盒磁珠、硅胶和羟基磷灰石等3种材料吸附橄榄油中DNA的能力,发现Wizard磁珠试剂盒法提取效果最好。Wu等[33]比较了Wizard磁珠纯化试剂盒和CTAB法对大豆油的提取效率,发现磁珠法提取DNA的扩增效率更高。2011年,该科研团队同样利用磁珠纯化试剂盒提取食用油中的DNA,完全满足后续PCR-CE-SSCP检测方法的要求[34]。杨冬燕等[35]比较了核酸富集处理前后3种核酸提取方法(DN easy® Plant Mini试剂盒法、Food EX Magnetic试剂盒法和CTAB法)对精炼食用植物油的提取效果。实验证实,磁珠试剂盒法(EX Magnetic试剂盒法)在采用核酸富集处理后,能扩增出目的片段的样品数量由原来的0个增加到6个,提取效率显著提高。

磁珠法通过特异吸附DNA去除了干扰后续反应的抑制剂,具有很好的纯化作用。此外,该法无需离心和加入多种试剂,操作简单,适合核酸自动化提取需求,是未来核酸提取方法的一个重要发展方向。

2.2.2 试剂盒法 试剂盒法是通过将提取食品中DNA所需的试剂和耗材整合在一起,从而可直接用于提取高质量DNA的方法,基于的主要原理有离心柱法、离子交换法及磁珠法等。由于该方法适用于同时提取多个样品,操作简便、快速、高效,无需酚氯仿抽提,避免有毒试剂的污染,从而受到科研人员的青睐。其中用于提取食用油中基因组的试剂盒种类繁多[36]。程红梅等[37]以大豆油为材料,建立了一种快速、简便提取大豆油中DNA的试剂盒法,能从10mL大豆油中提取0.4μg高纯度DNA。该方法用于提取市售的十几种精炼大豆油DNA并进行PCR检测,分别扩增出不同的目的片段。Spaniolas等[38]通过比较3种不同DNA提取试剂盒对葵花籽油和橄榄油的提取效果发现,QIAamp DNA Stool试剂盒获得比较强的PCR扩增信号相比其他两种试剂盒。Simona等[39]则运用扩增片段长度多态性的方法来评价贮藏时间对橄榄油DNA的影响,使用NucleoSpin Plant试剂盒(Macherey-Nagel,Düren,Germany)提取DNA达到了预期效果,结果显示一个月内生产的橄榄油提取DNA质量较好,一个月后提取DNA质量显著降低。Michelangelo等[40]为了建立辨别橄榄油真假属性的检测方法,比较了试剂盒法和改良CTAB法提取8种植物油中DNA的效果,结果发现试剂盒法提取DNA可扩增出对应目的条带,而CTAB法提取的DNA无扩增。除此之外,还有用于其他食品中(特别是深加工食品)基因组提取的试剂盒。庄逸林等[11]用改良的QIAGEN基因组提取试剂盒对番木瓜罐头进行核酸提取方法的优化,与改良的CTAB法相比,该方法成功提取了可用于PCR扩增反应的DNA。同样是番木瓜制品中DNA提取的方法研究,Kiyomi等[41]将不同样品经过适当前处理后使用不同试剂盒进行DNA提取。相比其他5种基因组提取试剂盒,QIAGEN的阴离子交换试剂盒(Genomic-tip 100G)获得较高纯度和产量的DNA,可用于转基因番木瓜的检测研究。Rafaat等[42]比较了6种从玉米及其衍生产品中提取DNA的方法,结果发现,Roche的DNA提取试剂盒从玉米的衍生产品中获得纯度最高的DNA,部分样品后续的PCR检测能检测到相应的外源基因。Angela等[43]则对比了2种不同试剂盒对深加工食品(如樱桃果酱、马铃薯水饺及巧克力等)的DNA提取效果,实验证实,Wizard® Magnetic DNA Purification for Food试剂盒对提取富含多糖和多酚化合物的食品中DNA的效果较好;而QIAGEN DNeasy® Tissue试剂盒对富含油脂食品的提取效果更加理想,具有特异、灵敏和重现性好的优点。

由于食品种类繁多且生产工艺复杂,其DNA提取技术应该有不同的针对性,不同的产品应该采用不同的试剂盒,而目前国内外用于提取食品中DNA的试剂盒却存在如下的问题:品种相对单一,难以满足各类食品特别是复杂食品的检测需求;标准化程度低和可操作性较差,按照说明书要求往往提取不到目标产物(主要针对深加工食品);国外试剂盒价格昂贵,造成检测成本升高。因此,要积极研发针对不同加工程度食品的DNA提取技术,提高其可操作性,促进其标准化,使该技术能得到广泛应用。

2.3 其他提取方法

植物源性食品中基因组的提取方法远不止上述四种类型,常见的还有高盐低pH法、尿素法及异丙醇沉淀法等。但是,由于技术条件的限制,这些方法并没有在食品分析领域获得广泛的认可和应用。曹文波等[44]建立了一种从玉米和水稻叶片中提取高质量基因组的改良尿素法,与传统方法(CTAB和SDS法)相比,该法具有产率高、快速简便、可常温操作、成本低等优点。王永等[45]曾以转基因大豆为研究材料,采用改良Chelex-100法和常规CTAB法进行基因组的提取比较和评价。结果表明,改良Chelex-100法的提取效率与CTAB法相当,且具有简便、快捷、经济的特点,可替代后者用于转基因检测。徐伟丽等[46]则以豆粉为材料来评价几种基因组提取方法的工作效率,在综合考虑DNA的纯度和浓度后认为几种提取方法的优劣依次为:改进热解法>改进异丙醇沉淀法>热解法>异丙醇沉淀法>高盐低pH法>改进CTAB法>CTAB法>改进SDS法。同年,该研究团队以生豆浆为研究对象,比较了热解法、异丙醇沉淀法、CTAB法、SDS法、高盐低pH和异硫氰酸胍法以及它们的改良方法的提取效果。结果显示,除异丙醇沉淀法外,其他方法提取的DNA均可满足PCR的检测需求[47]。

3 不同植物源性转基因食品DNA提取技术的方法比较

针对上文所述各种提取方法来看,目前并不存在一种通用型的植物源性转基因食品DNA的提取方法。传统方法虽然适用于大多数样品的DNA提取且成本低,但不宜大批量样品的DNA提取。此外,还存在使用的有机溶剂容易污染环境、操作相对剧烈从而对DNA有一定程度破坏及提取的DNA需进一步纯化等问题。新型方法往往已形成商品化且环保安全,适合大规模样品的DNA提取和高效纯化,但相对成本较高,而且需要专门的配套设备。由此可见,不同方法具有各自不同的优缺点,操作人员需要根据各自的食品类型和特点进行选择和优化,从而确定出最佳方案。

4 小结和展望

从理论上讲不论是经典提取方法还是商业化的试剂盒都可以用于食品中植物源基因组DNA的提取,但食品往往经历复杂的加工程序,其中产生的某些物理、化学或酶因子会严重影响其DNA质量,因此,在实际应用中其提取技术又不能与普通的植物组织相提并论。总结已有的DNA提取技术及其在食品中的应用研究,目前植物源性食品中DNA提取需突破的关键技术有:加强不同食品中含有的各种抑制剂的前处理技术;综合几种DNA提取方法进行优化,以便找到最适方法;针对片段小和含量低的情况,提高DNA的富集和纯化技术。总而言之,如何快速、高效、经济地从食品中提取到高产率和高纯度的DNA已成为转基因食品检测体系建立的重要制约因素。在食品工业化的今天,DNA提取技术的发展必须与食品基因检测的需求相适应,该技术的商品化和自动化将是未来发展的主流方向,这不仅能为检验机构提供便利,而且有利于检测方法的标准化,为转基因食品的安全标识提供有效的技术保障。

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Advances on extraction technologies of plant genomic DNA in food

ZHANG Juan,WU Wei-liang,TAN Jia-li,LIANG Yu-bin,LI Xiao-ming

(Guangdong Test Center of Product Quality Supervision,China National Food Quality Supervision and Testing Center,Foshan 528300,China)

How to acquire high purity and quantity plant genomic DNA in food has been an important step in genetically modified organisms(GMOs)detection. Several main extraction methods of plant genomic DNA were reviewed in this paper. The discussions were mainly focused on the advantages and disadvantages of several methods and the current status and perspectives of plant genomic DNA extraction technology in food,in order to supply some information for establishing the effective plant genomic DNA extraction method in food.

food;plant genome;DNA extraction

2014-06-13

张娟(1981-)，女，博士，主要从事转基因食品检测方面的相关研究。

广东省自然科学基金博士启动项目(S2012040007679);中国南方智谷引进创新团队项目(201209)。

TS207.3

A

1002-0306(2015)07-0396-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.075