谷苗苗, 王尉嘉, 王 迪, 周爱东

(1. 南京大学 金陵学院 化学与生命科学学院, 江苏 南京 210089;2. 南京大学 化学化工学院, 江苏 南京 210093)

紫外分光光度法测定可乐中咖啡因含量样品前处理方法探讨

谷苗苗, 王尉嘉1, 王 迪1, 周爱东2

(1. 南京大学 金陵学院 化学与生命科学学院, 江苏 南京 210089;2. 南京大学 化学化工学院, 江苏 南京 210093)

探讨了使用紫外分光光度法测定可乐中咖啡因含量过程中样品经有机溶剂萃取后,由于离心分离或静置不充分而产生吸光度增加的原因。通过实验验证萃取后离心(静置)步骤的必要性,比较了干燥、离心、静置和静置后离心4种前处理方法的相对误差,结果表明:离心分离可以减少水滴散射带来的误差,快速达到静置的效果并且节约时间,离心分离是最佳的样品前处理方式。

紫外分光光度法; 咖啡因; 离心分离; 样品前处理

咖啡因(C8H10N4O2)是从茶叶、咖啡果中提炼出来的一种甲基黄嘌呤的生物碱。它是一种中枢神经兴奋剂,适量食用咖啡因有祛除疲劳、兴奋神经等作用,临床上用于治疗神经衰弱和昏迷复苏,但是大剂量或长期使用有损人体健康[1]。在通常的饮料如咖啡、茶和可乐以及头痛药、止疼药中都发现有咖啡因的存在[2]。目前饮料中咖啡因的检测方法有:紫外分光光度法[3]、气相色谱法[4]、气相色谱-质谱仪联用[5]、高效液相色谱法[6]、毛细管胶束电动色谱法[7]、二阶导数光谱法[8-9]、咖啡因离子选择性电极[10]、氮蒽橙法[11]、HPLC-ES-MS法[12]等。

为培养学生创新意识和科学研究能力[13],我校在仪器分析实验教学中引入设计实验环节。在设计实验中发现:采用紫外分光光度法测定可乐中咖啡因含量时,同种可乐用三氯甲烷萃取后随静置时间的增加,吸光度值明显减小而后趋于稳定。本文深入研究了吸光度差异产生的原因，以及使用紫外分光光度法测定可乐中咖啡因含量时萃取之后静置或离心分离步骤的必要性。

1 实验

1.1 仪器与试剂

仪器有紫外分光光度计(UV22401PC)、超声仪。

试剂有咖啡因、三氯甲烷、无水硫酸钠，所用试剂均为分析纯，可乐饮料(市售)。

1.2 实验方法

咖啡因储备液配制:准确称取51.07 mg咖啡因标准样品,用三氯甲烷定容至50 mL,得到1.021 g/L咖啡因标准溶液。

1.3 样品萃取

取可乐饮料20～30 mL于50 mL烧杯中，超声脱气5 min除去CO2,准确取200L注入10 mL离心管中，加入4 mL三氯甲烷进行萃取,振摇2min,备用[2]。

2 结果与讨论

2.1 咖啡因标准曲线的绘制

在200～400 nm范围内扫描,得到咖啡因最大吸收波长为276.1 nm。图1为在最大吸收波长处测得的结果,咖啡因吸光度A-质量浓度c标准曲线回归方程为y=0.045 6x+0.028,相关系数r=0.999 9,表明咖啡因在1.0～40.0 mg/L范围内咖啡因吸光度-浓度呈良好的线性关系。

图1 吸光度-咖啡因浓度标准曲线

2.2 标准溶液模拟萃取-静置实验

首先取20 g/L咖啡因标准溶液,在波长276.1 nm处测定其吸光度值A0，A0=1.045。其次将20 mg/L咖啡因标准溶液经三氯甲烷萃取剂(咖啡因溶液与萃取剂的体积比为1∶20时,三氯甲烷一次萃取效率可达99.67%[2])充分混合后,迅速将该浊液倒入比色皿中,每隔一段时间记录一次吸光度值,并绘制吸光度-时间曲线(见图2)。从图2中可以看出,混合后刚开始的10 min内吸光度不稳定,一定时间后吸光度随时间的延长而下降,最后趋于稳定,若取稳定后的吸光度值A静置进行计算,则A静置=0.991,与A0比较相差不大。

图2 标液模拟萃取-静置实验吸光度-时间曲线

然后将比色皿重新震摇后,再次测得其吸光度值为1.129,放置一段时间后吸光度值又下降。此现象是由于有机相里的小水滴对光产生了散射,导致吸光度的上升,静置使有机相里的小水滴减少,对光的散射减弱,吸光度最终降到正常水平。因此静置是必要的,否则小水滴不能完全分离,使测得的吸光度偏大。

2.3 标准溶液模拟萃取-离心分离实验

20 mg/L咖啡因标准溶液经三氯甲烷萃取后以2 500 r/min离心10 min,取下层清液测定吸光度值，测得A离心=1.059,与A0相差不大。可见,离心分离也可以减少小水滴散射带来的误差,并且节约时间。

2.4 可乐样品萃取-静置实验

可口可乐样品萃取-静置实验结果见图3。

图3 可口可乐样品萃取-静置实验吸光度-时间曲线

由图3可以看出,可口可乐样品萃取后在静置过程中吸光度也呈现下降趋势。原因分析如下:当一束光照射在介质上时,会激起其中的电子作受迫振动,从而发出相干的次波。如果该介质在光波长(10-7m)尺度上分布均匀时,次波相干叠加会导致次波相消,只剩下遵循几何光学规律的光线;如果该介质不均匀,即在区域内介质的光学性质有较大差异时,次波无法相消,于是就形成了散射光[14]。散射体尺度小于入射光波长,则适用于瑞利散射;若散射体较大,则遵从米氏散射。不均匀团块的尺度远大于波长的数量级时,散射光又可以看成在这些团块上的反射和折射[14]。散射会使光在原来传播方向上的光强减弱,遵从如下指数规律[14]:I=I0e-(αa+αs)l=I0e-αl，式中:aa是吸收系数,αs是散射系数，两者之和α称为衰减系数,它表征光通过介质时因介质的吸收和散射的共同作用而使光强减弱的程度[15]。

用有机溶剂对咖啡因萃取后,如果静置或离心分离不充分,则会有各种尺度的小水滴分散在有机相中,形成散射体，使通过介质的光强度减弱,使得吸光度增加,造成测量不准确。

2.5 样品处理方式的选择

为了消除萃取时有机相中少量的水分的影响一般可采取4种方式:即干燥、离心、静置、干燥后离心。

(1) 干燥:取4mL标准溶液(10.42mg/L),加200L蒸馏水震荡3min,静置几秒移去上层明显水滴,然后用无水硫酸钠干燥,再用微孔滤膜过滤测其吸光度。

(2) 离心:取4mL标准溶液(10.42mg/L),加200L蒸馏水震荡3min,静置几秒移去上层明显水滴,然后2 500r/min离心3min,吸取下层测其吸光度。

(3) 静置:取4mL标准溶液(10.42mg/L),加200L蒸馏水震荡3min,静置几秒移去上层明显水滴后静置40min,测其下层溶液吸光度。

(4) 干燥后离心:取4mL标准溶液(10.42mg/L),加200L蒸馏水震荡3min,静置几秒移去上层明显水滴,用无水硫酸钠干燥,再用微孔滤膜过滤,然后2 500r/min离心3min,吸取下层测其吸光度。

测得的4种样品处理方式吸光度值和相对误差值(与标准液浓度10.42mg/L相比)见表1。

表1 不同样品处理方式的吸光度值和相对误差

由表1数据表明:静置的相对误差120%,是4种前处理方法中最大的,可能是因为将样品由离心管转移到比色皿中时受到震荡,使其吸光度升高,但是其后吸光度是有下降趋势的。

加入无水硫酸钠干燥相对误差较大，可能是无水硫酸钠除去了小液滴,同时引入固体颗粒。虽然使用了微孔滤膜过滤,但除去直径较小的固体颗粒依然存在困难,同样产生散射,使吸光度升高,回收率升高。

3 结论

由于萃取后静置或离心分离不充分,导致样品中的水分散在三氯甲烷中形成细小的水滴,这种水滴对光产生散射,使吸光度增大。离心可以有效地消除有机相中小水滴散射的影响。可乐样品前处理时,使用有机相萃取后只需离心处理就可以达到检测要求。使用离心分离处理后测得市售某批次常规可口可乐中咖啡因含量为96.4 mg/L,百事可乐中咖啡因含量为104.8 mg/L。

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[15] 姚启钧，华东师大光学教材编写组.光学教程[M].3版.北京:高等教育出版社,2002.

Discussion of pretreatment steps of determination of caffeine content in cola beverages with ultraviolet spectrophotometry method

Gu Miaomiao1, Wang Weijia1, Wang Di1, Zhou Aidong2

(1. School of Chemistry and Life Sciences,Nanjing University Jinling College, Nanjing 210089,China;2. School of Chemistry and Chemical Engineering,Nanjing University,Nanjing 210093, China)

In this work,the reasons why the absorption of the UV light became higher after extraction by the organic solvents when testing the caffeine content in colas in the method of ultraviolet spectrophotometry are discussed,and this phenomenon was caused by the insufficiency of centrifugal separation or still standing.The necessity of centrifugal separation (or still standing)after extracting is explained based on the experiment.Also,the recovery rates of the four pretreatment methods including drying,centrifugal separation,still standing and centrifugal separation after still standing are compared. The centrifugal separation is the best way of pretreatment, which could reduce the error caused by scattering droplets,achieve the static effect quickly and save time.

ultraviolet spectrophotometry method; caffeine; centrifugal separation; sample pretreatment

2014- 12- 11 修改日期：2014- 12- 28

2013年江苏省高等教育教改研究项目(2013JSJG168)

谷苗苗(1982—)，女，山东莱芜，硕士，讲师，主要从事仪器分析教学及实验室管理工作

E-mail：gumiaomiao@yeah.net

周爱东(1973—)，男，江苏淮安，博士，副教授，主要从事传质与分离研究及实验室建设与管理.

E-mail：zhouad@nju.edu.cn

G642.0;TS275

B

1002-4956(2015)6- 0042- 03