屈亚威，夏悯馨，刘海峰

宽视场荧光内镜的构建及其初步应用

屈亚威，夏悯馨，刘海峰

目的 为探索胃癌分子成像技术的新方法，构建一套新型灵活的宽视场荧光内镜系统，并用于裸鼠胃癌移植瘤模型荧光成像研究。方法 通过合理的光路设计及光学组件机加工，装配宽视场荧光内镜系统，通过对不同浓度的2-DG-750荧光探针进行成像，分析系统性能；对尾静脉注射100 μl 2-DG-750荧光探针的裸鼠胃癌移植瘤模型进行在体荧光成像，对ROI的像素值和成像图进行分析。结果 体外成像ROI的像素值与荧光探针浓度存在较好的线性回归关系，在2-DG-750剂量为31.3 pmol时，该系统即可检测到荧光信号，提示该系统灵敏性好；在体成像显示用该系统联合2-DG-750荧光探针观察到了肿瘤组织的较高荧光信号强度。结论 宽视场荧光内镜系统具有很好的灵敏性，可以同时实现白光及荧光的双模式成像，具有实现光学分子成像诊断胃癌的潜在应用价值。

荧光内镜；宽视场；近红外荧光探针；肿瘤检测

胃癌是我国高发的恶性肿瘤之一，内镜检查是发现胃肠道早期癌的最有效途径[1]。现有的白光内镜(white light endoscopy，WLE)对疾病的诊断依赖于可视化的形态学变化，然而多数早期胃癌形态学特征不明显，漏诊率较高[2]。另外，一些光学技术，如自体荧光(autofuorescence imaging, AFI)、色素内镜、富士能电子分光内镜技术(fuji intelligent color enhancement, FICE)和窄带成像技术(narrow band imaging, NBI)，虽然已经获得了比较好的临床应用效果[3-5]，但这些特殊光内镜成像技术仍难以实现特异性靶向成像，诊断仍依靠形态学改变。为了实现肿瘤特异性靶向成像，国内外学者探索研发了多种新型靶向荧光造影剂并在临床前的实验中取得了很好的效果，为胃癌光学分子成像的研究奠定了广阔的造影剂选择空间[6，7]。然而，体外荧光成像设备由于体积较大无法伸入生物体内，只能将靶组织或靶细胞分离后进行离体观察。为了满足体内活体成像的需求，基于光纤的荧光成像设备得到了快速发展[8，9]。本研究介绍了一种新型基于荧光宽视场内镜，并且利用该荧光内镜联合2-DG-750靶向荧光探针对裸鼠胃癌移植瘤模型进行了初步的成像研究，为分子成像技术诊断胃癌探索一种新的设备与方法。

1 材料与方法

1.1 材料 XenoLight RediJect 2-DG-750探针购买于美国PerkinElmer公司；BGC-803人胃癌细胞，由中国医学科学院肿瘤医院实验中心王铮博士惠赠；4～6周龄Balb/c裸鼠购买于中国医学科学院实验动物研究所；氙灯光源(MAX-303，Asahi Spectra, Torrance, US)、激发光滤光片(XBPA740，Asahi Spectra，Torrance，US)、发射光滤光片(FF01-840/12-25，Semrock，Rochester，USA)、背照式低温制冷CCD相机 (Clara, Andor, Belfast, Northern Ireland)由武警总医院中心实验室提供；传像光纤束、传光光纤束购买于南京春辉科技实业有限公司。

1.2 方法

1.2.1 搭建宽视场荧光内镜 本套灵活宽视场荧光内镜系统模式见图1。氙灯光源(a)的波长范围是从400～1000 nm，根据不同的荧光探针所需的激发光范围不同，可旋转氙灯(a)中的滤光系统(f1)至需要的波长范围。通过滤光片(b)过滤后的激发光平行地进入光传导通路(c)，并由光传导通路(c)中的独立光纤进行传导。而在成像暗箱(h)中，光传导通路(c)中的所有光纤被分隔开来，围在传像光纤(d)周围，这样是利用光的全反射现象，可以大大降低光的衰耗。传像光纤(d)是由相干光纤束和一个固定滤光片组成，这种相干光纤束直径大约1.8 mm，其中约有1000根光纤，在其远端末端，围绕激

发光纤形成一个闭路环，并且在其周围还有固定的镜片，这样可以提供宽视场照射。基于荧光的发射则是由固定滤光片和传出通路(d)收集。为了扩大成像画面，在CCD相机(g)的里面装上了大小合适的传感芯片(9.0 mm×6.7 mm)，反射激发光则由扩大系统(d)里的过滤系统(f2)过滤。在2-DG-750近红外实验中，有一个宽光谱滤光片(f1)，其主要波长为740 nm，另一个发射光滤光片(f2)，其主要波长是840 nm。荧光成像图片则由CCD相机(g)收集，系统的直径大约为3 mm。图2为宽视场荧光内镜系统实物图。

1.2.2 宽视场荧光内镜系统性能测试 2-DG-750用PBS稀释成6个不同浓度，放在96孔板中，第一排前3个孔装满蒸馏水作为对照。该系统末端在96孔板上方大约4 cm处，并用能量大约为2 mW的激发光照射在一个半径为2 cm的圆形区域。选择感兴趣区域(region of interest，ROI)测量其像素值。

图1 荧光内镜系统模式图

a. 光源, 300 W的氙灯; b. 滤光片; c. 传导通路; d. 传像光纤; e. 成像放大系统; f. 滤光系统；g. CCD数码相机；h. 成像暗箱

图2 荧光内镜系统实物

1.2.3 宽视场荧光内镜联合2-DG-750对裸鼠胃癌移植瘤在体成像探索

1.2.3.1 建立裸鼠胃癌皮下移植瘤模型 用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液(含青霉素100 U/ml，链霉素100 U/ml)在上述环境中培养BGC-803细胞，待细胞处于对数生长期时，用胰蛋白酶消化1～2 min，吹打分散细胞，用PBS调整细胞数量至3×107/ml，制成PBS细胞混悬液。随机选取2只裸鼠分别于右侧腋下接种0.2 ml PBS细胞混悬液，待肿瘤长至0.8～1.0 cm备用。

1.2.3.2 成像前准备 (1)禁食：荷瘤鼠和正常鼠均禁食12 h；(2)麻醉：异氟烷持续麻醉，裸鼠四肢无力，麻醉成功；(3)注射荧光探针：将裸鼠(荷瘤鼠、正常裸鼠)俯卧位固定于动物板上，取100 μl RediJect 2-DG-750荧光探针注入鼠尾静脉。

1.2.3.3 活体荧光分子成像 将2只荷瘤鼠在注射2-DG-750后1、3 h分别进行成像，系统对注射探针后的荷瘤鼠进行成像时，镜头离荷瘤鼠4～5 cm，这个距离是平时内镜工作时离黏膜的正常距离。首先在安装激发光滤光片(f1)，而未安装发射光滤光片(f2)的情况下，捕捉白光成像图；再者，如之前所述安装激发和发射滤光片，从而获得近红外成像图。

1.2.4 结果处理 采用FMT软件进行图像采集和分析。

2 结 果

2.1 宽视场荧光内镜系统特征测试 探索过程中得到该系统对2-DG-750荧光探针的最低灵敏剂量为31.3 pmol，显示了其较高的灵敏性。另外，像素值与荧光探针浓度存在较好的线性回归关系(图3)。

2.2 宽视场荧光内镜联合2-DG-750对裸鼠胃癌移植瘤的在体成像

2.2.1 建立裸鼠胃癌皮下移植瘤模型 2只裸鼠右侧腋下BGC-803细胞皮下接种后，均长出瘤体，后经病理证实为低分化胃腺癌。

2.2.2 活体荧光分子成像 在裸鼠胃癌移植瘤模型中，2-DG-750在移植瘤部位出现浓聚，能产生较强荧光(图4)。

图3 宽视场荧光内镜系统特性分析

A. 96孔板中稀释后不同浓度的2-DG-750的荧光成像图(曝光时间3 s)。A1-A3是蒸馏水作为对照，B1-C3是2-DG-750荧光探针的6个剂量梯度，依次为：1 nmol，500、250、125 、62.5、31.3 pmol。 B.不同浓度2-DG-750荧光探针相对应像素值与浓度的线性回归图，计算得其线性回归系数r=0.998

图4 宽视场荧光内镜联合2-DG-750对裸鼠胃癌移植瘤的荧光成像

3 讨 论

随着光纤的进一步改良，近年光纤光学成像设备得到了快速发展。为此，笔者介绍一种自主研发的光纤灵活宽视场荧光内镜，同时联合2-DG-750靶向荧光探针对裸鼠胃癌皮下移植瘤模型进行荧光成像探索，以探讨它用于肿瘤检测。本荧光内镜系统的优点：(1)直径大约为3 mm，可以通过内镜活检工作钳道，为今后进一步临床应用打下基础；(2)激发光纤与传像光纤采用共轴同心排列方式，较并行排列方式相比激发光照射部位与传像光纤图像采集部位具有更好的一致性，避免了因偏心造成假阳性病灶出现的可能；(3)可以根据需要灵活更换激发、发射滤光片；(4)用塑料外壳包绕光纤芯，从而利用光的全反射现象，大大降低光的衰耗，传像光路不需经过二向色镜分光，减少了光学信号的损失，缩短曝光时间，减少伪影出现的概率。本研究结果证明，通过宽视场荧光内镜可以对胃癌裸鼠模型进行荧光分子成像，为胃癌的荧光分子成像探索一种新的设备与方法。然而，由于缺乏临床上可用的靶向荧光分子探针，宽视场荧光内镜成像模式目前仍只处于临床前实验阶段。故本研究团队今后在致力于优化本套系统性能的同时，应进一步探索研发适合临床应用的荧光探针。

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(2014-12-06收稿 2015-02-08修回)

(责任编辑 武建虎)

Seting-up a wide-field fluorescence endoscopic and its preliminary application

Qu Yawei, Xia Minxin, and LIU Haifeng.

Department of Gastroenterology, General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces, Beijing 100039, China

Objective To setup a new flexible wide-field epi-fluorescence endoscope system, then make a fluorescence imaging for gastric cancer xenograft model in nude mice by this system, so as to setup a new device and method for the diagnosis of gastric cancer molecular imaging techniques. Methods The widefield fluorescence endoscope system was assembledusing the rational optical path and optical components machining. Different concentrations of 2-DG-750 fluorescent probe was used to analyze the performance of the imaging system.By intravenous injection of 100 μl2-DG-750 fluorescent probe into the xenografted tumor model,in vivo fluorescence imaging wasconducted, and ROI pixel values and imaging map were analyzed. Results The ROI pixel values demonstrated that a sensitivity of 31.3 pmoles 2-DG-750 was achieved as well as a good linear response from 1nmole to zero fluorescent probe. Fluorescence imaging indicated that gastrointestinal tumor tissues have an eminent 2-DG-750 uptake yielding a relatively strong fluorescence signal. Conclusions The new flexible wide-field epi-fluorescence endoscope system not only has a good sensitivity, but also can do a dual white and fluorescence imaging, which makes a promise future that optical technique will be applied to the diagnosis of gastric cancer.

fluorescence endoscopy; wide-field; near-infrared fluorescent probe; tumor detection

国家自然科学基金(81471700)

屈亚威，硕士，医师，E-mail：qyw198553@163.com

100039 北京，武警总医院消化科

刘海峰，E-mail：haifengliu333@163.com

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