徐 薪，纪小龙，徐明志

组织细胞在炎性肠病鉴别诊断中的意义

徐 薪1，纪小龙1，徐明志2

目的 研究炎性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)肠黏膜内组织细胞种类与分布特点,为其鉴别诊断寻找线索。方法 参照2012年中华医学会新制定的诊断标准选取病例，结合临床病史及内镜下表现做出诊断,确定溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)组 30例，克罗恩病(Crohn’s disease,CD)组 26例，选取10例正常肠黏膜作为对照组。所有病例均HE染色及加做6项免疫组化染色(CD1a、CD21、CD68、CD163、S-100、Ki-67)。所有切片均扫描进入优纳ISCAN系统进行半定量分析。结果 UC(80.72±17.15)个/104μm2及CD(78.59±16.37)个/104μm2的固有层内细胞数与正常对照组(59.57±14.04)个/104μm2相比均具有显著的统计学意义(P<0.01)。CD1a在正常肠黏膜及UC内几乎没有表达[(0.72±0.79)个/104μm2， CD(22.19±10.19)个/104μm2]统计分析比较与正常对照组及UC(1.32±2.26)个/104μm2均有统计学意义(P<0.05)。CD21在组织学上的鉴别诊断意义不大。S-100三组的组间比较均具有统计学意义(P<0.05)。CD68 CD组(16.02±7.33)个/104μm2的阳性细胞数少于正常对照组(21.92±6.18)个/104μm2和UC组(19.96±11.31)个/104μm2，与UC及正常对照组比较均具有统计学意义(P<0.05)。CD163染色时CD与UC组比较无统计学意义。 Ki67三组的组间比较均具有统计学意义(P<0.05)。结论 通过多种组织细胞免疫组化染色结果可以综合判断IBD的免疫状态及对UC和CD进行鉴别诊断。

炎性反应性肠病； 组织细胞； 免疫组织化学染色； 形态学

炎性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)是一种常见的慢性肠道疾病，主要包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)和克罗恩病(Crohn’s disease，CD)。两者的鉴别诊断一直是一大难题。本研究旨在为IBD的诊断及鉴别诊断方法发现新问题，找到新思路。

1 对象与方法

1.1 对象 选取2011-01-01至2013-06-30武警总医院病理科经消化科及病理科共同诊断为IBD的病例187例，重新查阅病史、内镜资料及重新阅片，根据2012年中华医学会消化病学分会炎性反应性肠病学组的炎性反应性肠病诊断与治疗的共识意见[1]的标准重新诊断，经筛选后的病例UC组 30例，CD组 26例，病变部位集中在回盲部距肛门口5 cm内。另外通过正常体检肠镜检查，选取10例正常大肠肠壁组织作为对照。

1.2 实验方法 每个蜡块按病理号进行连续切片7张，厚约5 μm，HE染色1张，选取了6种抗体分别进行标记，分别为CD1a、CD21、CD68、CD163、S-100、Ki-67。所选用抗体除CD163为中杉金桥生物技术有限公司提供外，均由北京西雅金桥生物技术有限公司提供。方法：常规两步法免疫组化染色。

1.3 计算分析 所有切片均扫描进入优纳ISCAN系统(由优纳数字医疗进行分析，半定量标准：在×40放大倍数下(目镜×10,物镜×4)，随机选择10个视野，取该放大倍数下细胞数/104μm2[3]。系统自动计算出ROI线内包含的细胞数，得出最终细胞数，进行统计分析。

2 结 果

2.1 正常对照组五种染色结果 正常对照组中，DC染色除CD1a与CD21比较无统计学意义，其他各抗体的比较结果均具有统计学意义(P<0.05)。巨噬细胞染色的CD68和CD163比较也具有统计学意义(P<0.05 ,表1)。

2.2 UC组五种染色结果分析 UC组的组织细胞染色结果为CD21、CD68和CD163(图1)，三组之间的比较无统计学意义。CD1a与其他四组抗体比较，差异均具有统计学意义(P<0.05，表2)。

表1 正常对照组组织细胞染色抗体的组间比较 ±s)

注：CD1a与其他抗体比较,①P<0.05； CD21与其他抗体比较,②P<0.05；CD68与其他抗体比较,③P<0.05； CD163与其他抗体比较,④P<0.05；与其他抗体比较, ⑤P<0.05

图1 UC组抗体染色图(×40)

±s)

注：CD1a与其他抗体比较,①P<0.05； CD21与其他抗体比较,②P<0.05；CD68与其他抗体比较,③P<0.05； CD163与其他抗体比较,④P<0.05；与其他抗体比较, ⑤P<0.05

2.3 CD组五种染色结果分析 CD组组织细胞染色结果分析(图2)，除CD163与CD1a及S-100比较无统计学意义外，其他各抗体之间的比较均具有统计学意义(P<0.05，表3)。

表3 CD组组织细胞染色抗体的组间比较 ±s)

注：CD1a与其他抗体比较,①P<0.05； CD21与其他抗体比较,②P<0.05；CD68与其他抗体比较,③P<0.05； CD163与其他抗体比较,④P<0.05；与其他抗体比较, ⑤P<0.05

3 讨 论

正常肠道的腺体之间散布着的细胞数量不是很多，平均细胞数为(59.57±14.04)个/104μm2。本研究发现，UC镜下表现是一个动态变化的过程，UC及CD的细胞数与正常对照组相比均具有统计学差异(P<0.01)。

单核巨噬细胞作为黏膜免疫的第一道防线，在炎性反应时对病原体具有很强的吞噬和溶解功能，同时还通过抗原递呈和分泌细胞因子激活特异性的宿主免疫反应。树突状细胞和巨噬细胞是两类最重要的专职抗原呈递细胞[3]。

3.1 树突状细胞 在体内数量较少，但分布较广，DC作为体内最强大的抗原提呈细胞,不仅可以诱导免疫应答，而且可以诱导免疫耐受。

CD1a为未成熟树突状细胞(immature DC，iDC)的特异性表面标志[4]。在正常肠黏膜内几乎没有表达。CD1a在UC固有层内可见到极个别阳性细胞，与正常肠黏膜内的分布比较无统计学意义，淋巴滤泡内则未见到阳性细胞。CD的CD1a阳性DCs主要在靠近上皮的固有层内聚集分布，部分散在。阳性细胞数要比正常对照组和UC多，小血管周围及淋巴细胞周围均可见到阳性细胞,平均细胞数：(22.19±10.19)个/104μm2。统计分析比较与正常对照组及UC均有统计学差异(P<0.05)。CD1a染色在正常肠黏膜及IBD的这种差别还没有报道。UC与CD虽然同为免疫性疾病，但二者的发病机制不同。

S-100蛋白是DC较好的标记物，S-100阳性DC作为一种免疫抗原提呈细胞分布于全身各器官组织中。正常对照组中S-100固有层内(阳性)。UC组S-100在固有层内分布广，与淋巴细胞接触紧密，且越靠近表面数量越多，平均细胞数：(37.14±15.04)个/104μm2。CD阳性细胞数少于UC(20.27±7.57个/104μm2)。三组的组间比较均具有统计学意义(P<0.05)。S-100染色阳性的DC细胞是比较成熟的DC细胞，三组间的差异，说明了正常对照组与IBD免疫状态的不同，并且UC的抗原提呈细胞要多于CD。

CD21用来标记滤泡树突状细胞(follicular dendritic cell,FDC)。正常肠黏膜内，CD21显示明确的网状结构。UC的CD21阳性细胞在固有层内可见到散在分布细胞。CD的CD21阳性细胞与上皮细胞及血管的关系比较密切。三者比较差异有统计学意义(P<0.05)。实际工作中，CD21主要用来标记滤泡树突细胞网，固有层内也可以见到散在分布的CD21阳性细胞， 由于CD21也可以使部分T、B染色，在组织学上的鉴别诊断意义不大。

3.2 巨噬细胞 在体内分布广，且具有强大的吞噬功能。巨噬细胞本身也是免疫效应细胞，活化的巨噬细胞可以杀伤病原体和肿瘤细胞[5]。

CD68染色组织细胞呈阳性。正常对照组CD68在固有层内阳性细胞数量相对较多，但上皮细胞之间未见阳性细胞，越靠近上皮部位阳性细胞数量逐渐增多。UC组的阳性细胞在固有层内密集分布，淋巴细胞聚集区则为阴性，与上皮细胞接触紧密，偶可见CD68阳性细胞进入到上皮细胞之间。CD组中的CD68分布情况与UC大致相同，在形成肉芽组织部位可见聚集现象。本研究结果显示，UC组与正常对照组比较无统计学意义。 而CD组的阳性细胞数少于正常对照组和UC组，与UC及正常对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。文献[6]报道，IBD时肠黏膜固有层内存在大量的CD68阳性细胞，与正常肠黏膜相比具有显著差异，提示IBD的发生与固有层内免疫细胞的增多可能存在一定的内在联系。本研究发现，CD的CD68阳性巨噬细胞少于UC组， CD68染色可作为UC与CD的鉴别诊断方法。

CD163限制性表达于单核/巨噬细胞系。文献[7]报道，CD163是单核巨噬细胞的特异性标记，早期免疫组化研究多用CD68作为巨噬细胞标记，但发现CD68还可表达于成纤维细胞、内皮细胞等细胞，因此不能作为巨噬细胞的特异性标记。

综上所述，消化内镜下取得的钳夹标本，只要取到了黏膜固有层，通过多种抗体的免疫组织化学染色结果综合分析，可以对UC与CD予以鉴别，为临床治疗提供参考。

[1] 中华医学会消化病学分会炎性反应性肠病学组.炎性反应性肠病诊断与治疗的共识意见(2012.广州)[J].中华内科杂志，2012，51(10)：818-831.

[2] 高英茂，宋天保.组织学与胚胎学[M].3版.北京：人民卫生出版社，2010：153-155.

[3] 纪小龙.消化道病理学[M].北京: 人民军医出版社,2010:383-387.

[4] 纪小龙，张 雷.诊断免疫组织化学[M].北京：人民军医出版社，2011：45-53.

[5] Caballero T, Nogueras F, Medina M T,etal. Intraepithelial and lamina proprialeuecxtyle subsets in inflammatory bowel disease: an immunohistocheical study of colon and biospy specimens[J]. J Clin Pathol, 1995, 48:743-748.

[6] 李 宁，刘冠贤，石咏军，等.树突状细胞与免疫调节的研究进展[J].西南军医，2010,12(3)：504-506.

[7] Steinman R M，Hawiger D，Liu K，etal. Dendritic cell funtion in vivo during the steady state: a role in peripheral tolerance [J]. Ann NY Acad Sci, 2003,987:15-25.

(2014-11-11收稿 2015-01-12修回)

(责任编辑 尤伟杰)

Significance of tissue cells in diagnosis of inflammatory bowel disease

XU Xin1，JI Xiaolong1，and XU Mingzhi2.

1. Department of Pathology，General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces，Beijing 100039,China;2.the Second Clinic, National Defense University of PLA, Beijing 100063,China

Objective Inflammatory bowel disease(IBD) includes ulcerative colitis(UC) and Crohn’s disease(CD). Definitive diagnosis of UC and CD relies on colonoscopy and biopsy, but it is difficult to give a definitive diagnosis for pathologists by specimens taken from colonoscopy. We hope that through the study for distribution and types of tissue cells within lesions ,looking for new clues to differential diagnosis.Methods Combining clinical history, endoscopy and the new standard, we remade the diagnosis, finally made sure of 30 cases of UC, 26 cases of CD, and 10 cases of normal intestine mucosa taken as the control. All the cases were re-stained by HE and two-step IHC for 6 items of antigens(CD1a、CD21、CD68、CD163、S-100、Ki-67), and these sections were analyzed by UNISCAN system to do semi-quota standard. The SPSS13.0 was used for statistics. The IHC was also analyzed through dividing the strength of the positive staining. Results The cell number in the CD and UC was significantly different from the control(P<0.01). In the CD mucosa, there were more positive cells than in the normal control and UC, with statistically significant difference(P<0.05).The CD21 expression could be the result of other cells stained, and had little diagnostic value. The S-100 positive cell types were rich in these 3 groups, in every two group with statistically significant difference(P<0.05).There was no CD68 expression statistically significant difference in the UC group compared with normal control(P>0.05), but the positive cell number in the CD group were less compared with the normal control and UC group, with statistically significant difference(P<0.05). There were rare Ki67 positive cells in the control group. In the UC group the Ki67 positive cells were more than in the CD group. Three groups of comparisons between groups were statistically significantly different (P<0.05).Conclusions These antibodies can be used as staining differential diagnosis of UC and CD. CD1a:UC(-),CD(+); Ki67 UC(+>10%),CD(+1%-2%);number of positive cells of S-100 and CD68， UC〉CD. The other antibodies can be used as auxiliary diagnositic means.

inflammatory bowel disease; tissue cells; immunohistochemistry; morphology

徐 薪，博士，主治医师，E-mail:xxblueflower@163.com

1.100039 北京，武警总医院病理科;2.100063 北京，国防大学第二门诊部

纪小龙，E-mail: geexl@126.com

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