王培晓，张 庆，张 力，张 慧，陈 虹，黄丽虹

乙肝相关性肝癌MLH1与p53的表达及其意义

王培晓1，2，张 庆2，张 力3，张 慧4，陈 虹2，黄丽虹5

目的 探讨MLH1与p53在乙型肝炎病毒 (hepatitis B virus ，HBV) 感染相关性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)中的表达及其意义。方法 选取原位肝移植手术术后HBV相关性HCC伴肝硬化患者238例，应用免疫组化的方法检测肝癌组织和癌旁组织中MLH1与p53的表达情况，并以25例正常肝组织和良性肝病组作为对照。结果 MLH1在肝癌组织的阳性表达率为31.09%(74/238)，在癌旁组织的表达阳性率为26.05%(62/238)，良性肝病对照组阳性表达率为48.00%(12/25)，各组表达的差异无统计学意义(P=0.053)。相关性分析显示，MLH1基因的表达与患者肝移植术前AFP含量(r=0.221，P=0.001)及术后的复发(r=-0.159，P=0.014)有相关性，与HCC组织病理学Edmondson分级(P=0.060)及TNM分期(P=0.065)有相关趋势。p53在肝癌组织的表达阳性率为47.06%(112/238)，在癌旁组织的表达阳性率为0.84%(2/238)，良性肝病对照组均为阴性，p53蛋白的表达在癌组织中明显高于其在癌旁及良性肝病中的表达(P=0.000)；p53表达情况与患者肝移植术前AFP含量有相关性(r=0.172，P=0.008)，与血管侵犯(P=0.053)及肿瘤数量(P=0.051)有相关趋势。结论 MLH1蛋白表达下调可能与HBV相关性肝癌的发生及术后的复发有关，且MLH1与p53蛋白在肝癌中的表达有一定的关联性。

肝细胞肝癌；乙型肝炎病毒；MLH1；p53；免疫组化

肝癌是世界上第5位常见恶性肿瘤，全球每年有近50万人死于肝癌,是近10年来发病率上升最快的肿瘤疾病之一，其病死率位于因癌症死亡疾病的第3位[1]。中国是肝癌的高发区，约80%以上肝癌发生与慢性HBV感染有关，10%与非乙肝非丙肝性因素相关。然而，肝癌的复发率较高，进展迅速，目前肝癌发生发展机制尚不十分明确[2]。MLH1与p53均与肿瘤的发生发展密切相关且均可能与肝癌相关，但关于MLH1与p53蛋白在HBV相关性HCC中的表达未见系统报道[3-16]。为此，笔者探究MLH1与p53在HBV相关性HCC中表达及其意义，并探究它们与临床病理特征间的相关性，以及两者在HBV相关性HCC发生发展中是否有关联。

1 材料与方法

1.1 材料 2003-01至2013-12在北京武警总医院行肝移植的患者238例，其标本蜡块保存较好且组织病理报告为HBV相关性HCC。手术标本经40 g/L中性甲醛溶液固定、石蜡包埋，4 μm厚度连续切片，进行免疫组化染色。同时，随机选取5例正常肝组织(健康供肝者的肝穿标本)及20例良性肝病(酒精性肝硬化5例、布加综合征5例、肝豆状核变性5例和自身免疫性肝病5例)组织作为对照组，良性肝病为临床上确诊的病例。此外，均设阳性对照及用 P B S 缓冲液代替一抗做阴性对照。一抗p53蛋白抗体是鼠抗人单克隆抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司，产品编号：ZM-0408，规格为0.1 ml装原液)。MLH1蛋白抗体是兔抗人单克隆抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司，产品编号：ZM-0154，规格为0.1 ml装原液)。二抗为通用型kit，PV-6000 山羊抗兔/小鼠IgG/HRP聚合物(北京中杉金桥生物技术有限公司，产品编号：PV-6000，规格为18 ml)。石蜡切片机(孝感市宏业医用器械BM-VX)，电热常温干燥箱(上海一恒隔水式GHP-9080)，显微镜(OLYMPUS CX21)。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化染色 根据PV-6000一步法试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)步骤进行。一抗稀释度为p53(1∶150)、MLH1(1∶165)。

1.2.2 p53蛋白和MLH1蛋白染色结果的判定标准 p53和MLH1阳性染色呈棕黄色颗粒。p53定位于细胞核，MLH1定位于细胞核，强度表达按阳性细胞着色强度由弱至强分别记分，细胞核无黄色颗粒样沉淀为0分、淡黄色为1分、棕黄色为2分、深棕黄色为3分；阳性细胞百分比对应的值：将阳性的细胞数<5%算为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，>50%为3分；然后将染色强度+阳性细胞百分比对应的值作为评分，0分为阴性，1～2分为+，3～4分为++，5～6分为+++。

1.2.3 复发判断指标 术后通过每月复查肝脏B超、胸片和血清AFP水平等方法，检查患者肿瘤复发转移情况, 发现可疑癌灶或阳性结果后立即行CT、MRI或PET-CT检查。每3～6个月复查一次胸、腹部CT或核磁检查。

1.3 统计学处理 采用SPSS19.0软件进行卡方检验及Spearman秩相关分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 免疫组化结果

2.1.1 MLH1蛋白在HBV相关性HCC中的表达情况 MLH1定位于细胞核(图1A、B)，阳性染色呈棕黄色颗粒。癌组织：阴性(-)164例，弱阳性(+)31例，中等阳性(++)33例，强阳性(+++)10例，各部分所占构成比为68.91%、13.02%、13.87%和4.20%。在癌旁组织：阴性(-)176例，弱阳性(+)3例，中等阳性(++)36例，强阳性(+++)23例，表达阳性率为26.05%。在良性肝病及供肝中的表达阳性率48.00%(12/25)，阴性(-)14例，弱阳性(+)5例，中等阳性(++)6例，强阳性(+++)5例。卡方检验差异无统计学意义(P=0.056)。

图1 MLH1与p53在HBV相关性HCC组织中阳性表达

2.1.2 p53蛋白在HBV相关性HCC中的表达情况 p53定位于细胞核(见图1C、D)，癌组织：阴性(-)126例，弱阳性(+)17例，中等阳性(++)42例，强阳性(+++)53例，表达阳性率为47.06%。在癌旁组织：阴性(-)236例，弱阳性(+)0例，中等阳性(++)1例，强阳性(+++)1例，表达阳性率为0.84%。在25例对照组中的表达为0。肝癌组织中p53的表达与其在癌旁和良性肝病组织中的表达有差异(P=0.000)。

2.1.3 MLH1蛋白与p53蛋白在HBV相关性HCC中的表达相关性分析 应用Spearman秩相关分析MLH1与p53有一定的相关性(r=0.195，P=0.013)。其中，蛋白表达强阳性比例p53蛋白(21.85%)明显高于MLH1蛋白(4.20%)(P=0.000)；相反，蛋白表达阴性及弱阳性比例MLH1(81.52%)明显高于p53蛋白(60.08%)(P=0.000)；蛋白表达中等阳性分别为MLH1(13.87%)和p53蛋白(17.65%)，差别无统计学意义(P=0.258)。

2.2 p53蛋白和MLH1蛋白的表达情况与HBV相关性HCC的临床病理特征的分析 见表1。p53表达情况与临床病理特征相关性分析表明，AFP含量存在一定的相关性(r=0.172，P=0.008)，与血管侵犯(P=0.053)及肿瘤数量(P=0.051)有相关趋势；MLH1蛋白表达通过与临床病理特征的等级相关性分析，MLH1基因的表达与HBV-HCC肝移植术后的复发(r=-0.159，P=0.014)及AFP含量(r=0.221，P=0.001)有一定的相关性，与组织病理分级(P=0.060)及TNM分期(P=0.065)有相关趋势，而与HBeAg、血管侵犯、淋巴侵犯、肿瘤数量等无明显的相关性。

表1 乙肝相关性肝癌MLH1与p53表达情况与临床病理特征的关系 (n=238)

注：r为相关系数,P为r取值概率

3 讨 论

肝癌的发生和演变是多阶段和多基因参与的极为复杂的生物学过程，其中DNA损伤的修复是重要的一环，若DNA损伤未能及时得到修复致使损伤积累，导致基因的功能改变，将会促进肿瘤的发生发展。DNA损伤修复系统在修复DNA碱基错配、增强DNA复制的准确性、维持基因稳定性和降低自发性突变防止损伤积累方面上有着重要的作用[3]。其中MLH1基因是MMR中重要的一个功能基因，对于MMR的功能发挥有着重要影响[4-7]。多数研究都是应用的细胞遗传学方法技术，例如基因杂交或者PCR等，只有少数的几个实验研究应用免疫组化的方法揭示MLH1基因表达分布与肝癌的关系[5-9]。

本研究中238例HBV相关性HCC病例中，免疫组化结果中MLH1蛋白表达部位在细胞核，表达阳性率为30.77%，但通过与癌旁及良性肝病的比较并未发现明显的差异性，MLH1基因表达与肝癌患者的临床病理特征：HBeAg、血管侵犯、淋巴侵犯、肿瘤数量等亦无明显的相关性，但MLH1基因的表达与HBV相关性HCC肝移植术前AFP含量与术后复发有一定的相关性，与组织分级及TNM分期有相关趋势，说明表达减少可能会促进肝癌的复发及肿瘤的恶化。有研究显示[5-7]，MLH1基因在HCV感染相关性肝癌中的表达阳性率分别为75%、80%及93.41%，且其表达与肝癌发生、发展无明显相关性。但其中只是部分涉及HBV相关性HCC。另外有研究也从另一方面支持这一结论，甲基化导致的基因沉默促进DNA损伤积累的作用在肝癌发生发展的过程中并不明显[8]。Helal TE等[9]的研究中50例HCV相关性肝癌病例中24例MLH1蛋白阳性，阳性率为48%。在该研究中支持MLH1基因低表达在肝癌发生发展中有明显相关性，特别是在高去分化的肝癌发生发展过程中，有研究[7]也支持在分化程度较差的肝癌中MLH1明显减少。不同的结果可能是对照的良性肝病组病例数太少，或者因为所用抗体种类和病例来源不同所致，特别是病例来源，病例的种族差异、地域差异及病毒感染的不同基因型等。而且肝癌的发生发展本就是一个多步骤多因素多基因参与的过程，可能在某一环节有MLH1基因的参与，在肝癌的进展过程中，恶性改变过程中及肝移植术后的复发过程中有该基因的参与。

国内外研究显示[10，11]，野生型p53参与基因转录、DNA损伤与修复、细胞周期调控、细胞凋亡、细胞增殖及细胞分化等多个过程，并且有抑制肿瘤新生血管的作用。而突变型的p53却有促进肿瘤的发生发展的作用，p53基因突变出现于50%的肿瘤患者，并其还有一部分的患者虽无p53 突变但也经常有 p53 通路的部分失活。在肝癌的发生发展中同样有着重要的作用[12]。在人群中研究HBV感染单独因素能否引起p53突变有一定难度，因为在中国HBV感染高流行区域大多也是黄曲霉毒素水平高的地区，因为有其他混杂因素的存在，如今的研究也是结果不尽相同[13]。突变型p53基因在乙肝相关性肝癌中的表达尚不明确，相关研究较少且样本例数较少，在HBV相关性HCC中突变型p53分别为4/8与6/11[14，15]。本研究通过对238例乙肝相关性肝癌患者的组织应用免疫组化法检测p53的表达。结果显示p53主要表达部位为癌细胞核上，阳性率为47.06%，而仅2例p53在癌旁呈阳性表达，在30例良性肝病和健康供肝组中均为阴性。与HBV-HCC患者的临床病理特征分析：p53表达情况与临床病理特征相关性分析AFP含量存在一定的相关性，与血管侵犯有相关趋势。

本研究结果显示MLH1蛋白与p53蛋白表达有相关性。有研究表明DNA错配修复系统(MMR)基因MLH1主要通过激活p53和线粒体调亡通路参与雌激素诱导的人结肠癌细胞株HCT116凋亡，具有激活p53通路的作用，且显示顺铂、烷化剂等多种损伤DNA介质诱导的细胞凋亡有MMR基因与p53等相关基因的协同作用[16]。推测：MLH1基因与p53基因在HBV相关性肝癌的发生发展中可能具有协同作用，但其具体机制还不甚清楚。

综上所述，MLH1蛋白表达下调可能与HBV相关性肝癌的发生及术后的复发有关，并且MLH1与p53蛋白在肝癌中的表达有一定的关联性。p53蛋白在HBV相关性肝癌的组织中表达的程度及强度较MLH1蛋白特异性强。推测MLH1基因与p53基因可能协同参与HBV相关性肝癌发生发展。但相关机制还有待进一步的探究。

[1] 全紫薇, 陶 蔷. 肝癌的影像学检查方法研究进展[J]. 医学研究杂志, 2013, 42(9)：159-162.

[2] 陈建国. 中国肝癌发病趋势和一级预防[J]. 临床肝胆病杂志, 2012，28(4)：256-260.

[3] 吴俚蓉, 胡春宏. DNA错配修复基因hMLH1与肿瘤及化疗耐药相关性的研究进展[J]. 临床肿瘤学杂志, 2009, 14(3)：274-278.

[4] 莫海英, 耿 明, 刘 峰. 子宫内膜癌组织中DNA错配修复基因表达及意义[J]. 山东医药, 2014, 54(38)：37-39.

[5] Matsukura S, Miyazaki K, Yakushiji H. Combined loss of expression of O6-methylguanine-DNA methyltransferase and hMLH1 accelerates progression of hepatocellular carcinoma[J]. J Surg Oncol, 2003,82(3): 194-200.

[6] Matsukura S, Soejima H, Nakagawachi T,etal. CpG methylation of MGMT and hMLH1 promoter in hepatocellular carcinoma associated with hepatitis viral infection[J]. Br J Cancer,2003, 88(4): 521-529.

[7] Wani Y, Notohara K, Tsukayama C. Reduced expression of hMLH1 and hMSH2 gene products in high-grade hepatocellular carcinoma[J]. Acta Med Okayama, 2001,55(2): 65-71.

[8] Li Z, Zhang H, Yang J. Promoter hypermethylation of DNA damage response genes in hepatocellular carcinoma[J]. Cell Biol Int, 2012, 36(5): 427-432.

[9] Helal T E, Khamis N S, El-Sharkawy T M. Immunohistochemical expression of mismatch repair genes (hMSH2 and hMLH1) in hepatocellular carcinoma in Egypt[J]. APMIS, 2010,118(12):934-940.

[10] 汪海新, 应明真, 王 梅. ER、PR、HER-2、P53在乳腺浸润性导管癌组织中的表达及临床意义[J]. 医学研究杂志, 2013, 42(2)：27-31.

[11] Levine A J, Oren M. The first 30 years of p53: growing ever more complex[J]. Nat Rev Cancer,2009, 9(10): 749-758.

[12] 郭晓东, 熊 璐, 曹晨等. 抑癌基因p53在肝癌组织中的异常表达及临床意义[J]. 现代生物医学进展 , 2012, 12(1)：66-68.

[13] 王 岩, 黄 坚. TP53通路分子遗传学改变与肝细胞癌[J]. 实用肝脏病杂志,2013, 16(5)：474-477.

[14] Mohamed W S, Omar M M, Khayri T M. Assessment of the Proliferative Marker Ki-67 and p53 Protein Expression in HBV- and HCV-related Hepatocellular Carcinoma Cases in Egypt[J]. Int J Health Sci (Qassim),2008, 2(1): 27-34.

[15] Greenblatt M S, Feitelson M A, Zhu M,etal. Integrity of p53 in hepatitis B x antigen-positive and -negative hepatocellular carcinomas[J]. Cancer Res,1997, 57(3): 426-432.

[16] 吕晨曦, 王德智, 金 鹏. 错配修复基因MLH1激活p53和线粒体凋亡通路参与雌激素诱导的结肠癌细胞凋亡[J]. 胃肠病学,2014,19(5)：279-283.

(2015-02-09收稿 2015-03-24修回)

(责任编辑 梁秋野)

Significance of MLH1 and p53 expression in HBV related- hepatocellular carcinoma

WANG Peixiao1,2,ZHANG Qing2,ZHANG Li3,ZHANG Hui4,CHEN Hong2,and HUANG Lihong5.

1.Graduate Division of Xinxiang Medical University，Xinxiang 453003,China;2.Institute of Organ Transplantation, 5.The Graduate Student Affairs Office，General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces, Beijing 100039,China;3.First Department of Surgery, Shaanxi Provincial Corps Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces, Xi’an 710054, China；4.Department of Gastroenterology ，Luoyang Dongfang Hospital，Luoyang 471003,China

Objective To study the expression of MLH1 and p53 in HBV related- hepatocellular carcinoma(HCC), both of the specificity of the expression. Method Objects were 238 patients of HBV related-HCC with cirrhosis in this hospital who had been in the liver transplantation operation from 2003 to 2013. We examined the expression of MLH1 and p53 in 238 patients with HCC and adjacent tissues by immunohistochemistry.As the normal controls were normal liver tissue and benign liver disease. Results The expression of theMLH1postive in the HCC tissues was 31.09%(74/238), with 26.05%(62/238) in cancer adjacent tissues，with 48.00%(12/25)in benign liver diseases tissues. The expression in each group had no significant difference (P=0.053). However,by clinicopathologic rank correlation analysis， the expression of MLH1 was associated with tumour recurrence after liver transplantation (r=-0.159，P=0.014)and the AFP levels (r=0.221,P=0.001),and had certain trend with Edmondson-Steiner Grading(P=0.060)and TNM(P=0.065). The expression of the p53 postive in the HCC tissues was 47.06%(112/238),with 0.84%(2/238)in the cancer adjacent. However, the expression of benign liver diseases tissues were all negative.The expression of p53 protein in tumour tissues was significantly higher than that in cancer adjacent tissues and benign liver diseases tissues (P=0.000),There was association between expression of p53 and vascular invasion (P=0.053) and tumorons numbers (P=0.051). Conclusion Down-regulation of MLH1 expression at the mRNA and protein levels is observed in association with developing hepatocellular carcinoma and relapses. MLH1 has significant correlation with p53.

hepatocellular carcinoma; HBV; MLH1; p53; Immunohistochemistry

首都临床特色应用研究项目(Z121107001012168)、国家自然科学基金项目(81372595)

王培晓，硕士，E-mail:995816449@qq.com

1.453003，新乡医学院研究生院；100039 北京，武警总医院:2.肝移植科，5.研究生办；3.710054 西安，武警陕西总队医院普通外科；4.471003，洛阳东方医院消化肝病科

黄丽虹,E-mail:xiao.1015.y@qq.com

R730.23