徐 明 徐福元 吴小芹

(1.江苏省林业科学研究院，江苏 南京 211153，2.南京林业大学林学院，江苏 南京 210037)



苏云金杆菌和灭幼脲混剂对美国白蛾幼虫2种酶活性的影响

徐 明1徐福元1吴小芹2

(1.江苏省林业科学研究院，江苏 南京 211153，2.南京林业大学林学院，江苏 南京 210037)

通过室内外毒力测定和防治试验发现,苏云金杆菌(Bt)+灭幼脲混剂对美国白蛾2 ～ 3代4龄幼虫有较强增效作用,在此基础上分析该混剂对白蛾4龄幼虫体内中肠几丁质酶和乙酰胆碱脂酶(AChE)活力的影响。结果表明：5种浓度的Bt、灭幼脲及其混剂对白蛾4龄幼虫体内中肠几丁质酶活力的影响随处理浓度增高和处理时间延长抑制作用越明显，且差异极显著，说明Bt+灭幼脲混剂均有抑制白蛾4龄幼虫中肠几丁质酶活力的作用，是该混剂对白蛾4龄幼虫提高毒杀效果的原因；5种浓度Bt+灭幼脲及其混剂处理对白蛾4龄幼虫体壁AChE活性的影响随处理时间的增加有先升高后降低的趋势，36～96 h具诱导幼虫体壁AChE活性逐渐增强的趋势，96 h后活性明显减弱， AChE活性减低后白蛾4龄幼虫很快死亡，对AChE活性抑制率为20.13%～90.00%，为Bt+灭幼脲混剂增效关键作用的另一个原因。

美国白蛾；苏云金杆菌；灭幼脲；中肠几丁质酶；乙酰胆碱酯酶

美国白蛾(Hyphantriacunea)是一种非常猖獗的危险性害虫，具有食性杂、危害大、繁殖快、易传播等特点，属世界性检疫对象，2010年起该虫害在江苏连云港、徐州、宿迁和盐城等市爆发。目前，该害虫向江苏周边地区扩散蔓延的势头仍在加剧，严重威胁当地的城市绿化、林果业和养蚕业等行业的发展。用苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis，Bt)与灭幼脲(chlorbenzuron)混合剂防治美国白蛾幼虫有显著致死增效作用[1]，对美国白蛾生物、无公害防控提供了新的研究方向。中肠是昆虫消化吸收食料的重要场所，更是Bt毒蛋白和灭幼脲杀虫机理研究涉及的重要组织。Bt的主要杀虫机制是昆虫食人毒蛋白晶体后，在中肠高pH环境和蛋白水解酶的作用下，毒蛋白晶体溶解并被激活。活化的蛋白引起中肠膜上皮细胞裂解、中肠麻痹，使昆虫几天内死亡[2]。灭幼脲主要是胃毒剂。昆虫取食后，首先会直接影响消化道的功能，使多种酶的活力下降，从而使昆虫产生厌食，生长延缓，体重减轻[3]。几丁质酶(chitinase)是一类能把几丁质降解为N.乙酰.D.氨基葡萄糖或寡聚N.乙酰胺基葡萄糖的水解酶，可以降解几丁质为低分子量、可溶或不可溶的寡糖。该酶广泛存在于各种真菌、植物、昆虫和鱼类等生物中，催化水解昆虫几丁质的酶主要是几丁质酶，通过阻断几丁质酶，阻止昆虫蜕皮、化蛾和围食膜的再生，以达到杀灭昆虫的目的[4]。昆虫体内另一种重要的解毒酶系是以乙酰胆碱酯酶(acetylcho1inesterase，AChE)为代表的，它对分解外源毒素、维持昆虫本身正常的生理代谢起着重要作用。AChE是生物体内神经传导过程中执行重要功能的一种关键酶,该酶通过催化降解神经递质乙酰胆碱(acetylcholine，Ach)，终止其对神经突触后膜兴奋的刺激作用，以维持神经冲动在生物体内的正常传递[5]，该酶抑制的昆虫会兴奋至死亡。本研究拟采用生化测定法研究其对美国白蛾幼虫中肠chitinase和体壁AChE靶标酶活力的影响[6-8]，探讨Bt+灭幼脲混剂对美国白蛾幼虫的增效机制，以期为Bt+灭幼脲混剂的研发和推广运用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料与供试药剂

美国白蛾(简称白蛾)4龄幼虫。

苏云金杆菌(Bt)悬浮剂，毒力效价为8 000 IU/μL，(扬州绿源生物化工有限公司生产)；34%灭幼脲原药(安阳市瑞泽农药有限公司生产)。

恒温水浴锅：上海申生科技有限公司生产；SpectraMax M2 酶标仪：美国分子仪器公司生产；Heraeus biofuge 台式高速离心机：D37520型，德国Kendrc公司生产；台式低速离心机：TD5A-WS型，长沙湘仪离心机仪器有限公司生产；分析天平(0.1 mg)：BS110S，赛多利斯；电热恒温干燥箱：DHG-9070A型，上海精宏试验设备有限公司生产；混合球磨仪：德国莱驰 RETSCH MM400；电泳槽型号为Bio-Rad Mini Protean Tetra Cell，电泳电源为Bio-Rad PowerPac Basic。

1.2 Bt 与灭幼脲混剂对白蛾4龄幼虫的室内联合毒力测定

1.2.1 药剂配制

1) 单剂：将供试Bt分别等比稀释为0.80、0.40、0.20、0.10、0.05 IU/μL和0.025 IU/μL 6个浓度；将供试灭幼脲分别等比稀释为2.500、1.250、0.625、0.313、0.156 mg/L和0.078 mg/L 6个浓度。

2) 混剂：Bt+灭幼脲混剂是将上述2种供试单剂各减半混配后，分别将其等比稀释为0.4 IU/μL+1.250 mg/L、0.2 IU/μL +0.625 mg/L、0.1 IU/μL +0.313 mg/L、0.05 IU/μL +0.156 mg/L、0.025 IU/μL +0.078 mg/L和0.012 5 IU/μL +0.039 mg/L 共6个浓度，联合毒力测定方法和效果见文献[4]。

1.2.2 供试幼虫取样方法 将新鲜复叶槭树叶片在上述配制的各浓度药液中速浸20 s，晾干后叶片放入直径15 cm的大培养皿中，每处理浓度接4龄幼虫30头，以无菌水为对照，重复3次，用药后分6、12、24、36、48、72 、96 h取样幼虫供中肠Chitinase 和体壁AChE靶标酶活力的测定。

1.3 Bt+灭幼脲混剂对白蛾4龄幼虫酶活性的变化测定方法

1.3.1 中肠几丁质酶测定方法

1) 粗酶液的提取。中肠样品送来时每管约为1 mL，在此管中加3个钢珠，直接进行球磨匀浆。球磨匀浆是将样品(中肠或体壁)在预冷条件下进行的。球磨条件：频率为10次/秒，时长为1 min，重复3次。匀浆液于4 ℃，12 000 r/min 条件下离心5 min，取上清液即为粗酶提取液。

2) 几丁质酶活力测定。N-乙酰葡萄糖胺标准曲线的制作。取9支试管(标号0，1～8)，按顺序分别加入0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.12、0.16、0.20 mL和0.24 mL N-乙酰葡萄糖胺溶液，再用水补足到0.40 mL，加0.2 mL的饱和硼砂溶液，沸水浴7 min， 冷却后加2 mL 冰醋酸和1 mL 1%的对二甲氨基苯醛(DMAB)溶液， 37 ℃保温15 min 后，测定585 nm下的吸光值，其中以0号管作对照。以N-乙酰葡萄糖胺含量(μg/mL)作横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。

几丁质酶活力测定。参照肖拴锁等[6]的方法略作改动，取粗酶液0.1 mL，加入乙酸缓冲液0.1 mL(0.1 mol/L，pH 5.8)，0.1 mL胶体几丁质，37 ℃下反应3 h，3 000 r/min离心10 min，取0.1 mL上清液，加入0.01 mL的1%蜗牛酶，37 ℃反应1 h，以同样处理的包括底物和酶(加热失活)的反应液为对照。

测定产生的N-乙酰葡萄糖胺的含量。取0.1 mL上清液，加0.05 mL的饱和硼砂溶液，沸水浴7 min，冷却后加0.5 mL冰醋酸和0.25 mL 1%的对二甲氨基苯醛(DMAB)溶液，37℃保温15 min后，测定585 nm下的光密度。

酶活定义为在上述条件下，1 h催化生成1 μg N-乙酰葡萄糖胺的酶量为1个酶活单位(U)。

1.3.2 体壁AChE测定方法 测定方法参照改进的Ellman法[7-8]，作为底物的碘化硫代乙酰胆碱被AChE分解为乙酸和硫代胆碱，硫代胆碱与DTNB作用，生成一种黄色的络合物，在412 nm下比色。分别取0.025 mL的磷酸缓冲液(0.1 mol/L)和粗酶液加入1.5 mL Ependoff管中，充分混匀，35 ℃水浴10 min 后加入0.05 mL 碘化硫代乙酰胆碱(1 mmol/L)，反应10 min 后加入0.9 mL DTNB-磷酸盐-乙醇溶液显色并终止反应，以0.05 ml蒸馏水代替底物作为空白对照，于412 nm 下测定其光吸收值，每处理重复3次。

产物浓度：C=ΔOD/(ε×L)式中：ΔOD为吸光度的变化值；ε为产物与DTNB络合物的摩尔消光系数，ε=13 600L/(mol·cm)；L为光程。

酶活以单位质量体壁单位时间水解得到的产物的物质的量计算，酶活性由酶促反应的初速度来确定。

1.4 数据分析

采用DPS 7.0.5进行方差分析，用Duncan(新复极差法)分别在0.05和0.01水平下检验各处理间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 Bt+灭幼脲混剂对白蛾4龄幼虫的毒力及药效测定结果

经室内外毒力测定和防治试验结果表明，Bt+灭幼脲混剂对白蛾二代、三代4龄幼虫的毒力均较高，灭幼脲对白蛾二代幼虫的毒力指数为124.20，分别高于混剂对二代(113.07)、三代(115.48)幼虫的毒力指数，具有较强的增效作用；联合毒力分析增效达0.76和0.83倍，有较强的增效作用。混剂在试验林间防治的毒杀效果和速率也要高于单剂[1]，这与岳书奎等用Bt制剂与灭幼脲3号混合防治落叶松毛虫(Dendrolimussuperans)二龄幼虫有明显的增效作用的试验结果一致[9]。

2.2 不同处理对白蛾4龄幼虫体内中肠几丁质酶活力的影响

2.2.1 不同浓度Bt处理对白蛾幼虫体内中肠几丁质酶活力的影响 不同浓度Bt处理对白蛾4龄幼虫体内中肠几丁质酶活力的影响见图1。

由图1可知，Bt处理对白蛾4龄幼虫体内中肠几丁质酶活力存在影响，其中处理6 h时对4龄幼虫体内该酶活力具有激活作用，处理12～24 h对4龄幼虫体内该酶活力具有明显抑制作用。因此，Bt处理能有效干扰白蛾4龄幼虫正常的生理代谢，从而起到毒杀作用。Bt处理白蛾4龄幼虫后，其体内的几丁质酶活力呈逐渐降低趋势，6 h处理组的几丁质酶活力与同期对照有明显差异，36 h时低于同期对照，至48 h后几丁质酶活力除0.8 IU/μL和0.1 IU/μL处理外，其余均低于对照，差异极显著(P<0.01)。分析结果表明，Bt处理对白蛾4龄幼虫体内中肠几丁质酶活力有抑制作用，且随浓度增高和培养时间延长抑制作用越明显。

2.2.2 不同浓度灭幼脲处理对白蛾幼虫体内中肠几丁质酶活力的影响 不同浓度灭幼脲处理对白蛾4龄幼虫体内中肠几丁质酶活力的影响见图2。

由图2可以看出，5种浓度的灭幼脲对4龄幼虫的几丁质酶活力均存在不同程度的调节作用，其中对处理6 h时4龄幼虫体内该酶活力具有激活作用，处理12 h后对4龄幼虫体内该酶活力具有明显抑制作用。灭幼脲处理白蛾4龄幼虫后，其体内的几丁质酶活力呈逐渐降低趋势，处理6 h的几丁质酶活力与同期对照有明显差异，36 h低于同期对照，至36 h后几丁质酶活力除2.5 mg/L处理外其余均低于对照，差异极显著(P<0.01)。测定结果表明，灭幼脲处理对白蛾4龄幼虫体内中肠几丁质酶活力有抑制作用，且随浓度增高和培养时间延长抑制作用越明显。

2.2.3 不同浓度Bt+灭幼脲混剂处理对白蛾幼虫体内中肠几丁质酶活力的影响 不同浓度Bt+灭幼脲混剂处理对白蛾4龄幼虫体内中肠几丁质酶活力的影响见图3。

由图3可以看出，5种浓度的混剂对4龄幼虫的中肠几丁质酶活力均存在不同程度的调节作用，其中对处理6 h 时4龄幼虫体内该酶活力具有激活作用，处理12 h后5种浓度的混剂对4龄幼虫体内该酶活力具有明显抑制作用。混剂处理白蛾4龄幼虫6 h后，其体内中肠几丁质酶活力呈逐渐降低趋势，处理组的中肠几丁质酶活力与同期对照具有明显差异，36 h后除0.4 IU/μL+1.25 mg/L和0.2 IU/μL +0.625 mg/L处理外，其他浓度处理的中肠几丁质酶活力均低于对照，差异极显著(P<0.01)。说明混剂处理对白蛾4龄幼虫体内中肠几丁质酶活力有抑制作用，且随浓度增高和处理时间延长抑制作用越明显。

2.3 不同处理对白蛾4龄幼虫体壁AChE的影响

2.3.1 不同浓度Bt处理对白蛾幼虫体壁AChE的影响 灭幼脲进入虫体后，很可能首先干扰了虫体内的激素平衡。因体内DNA 的合成、各种酶(包括几丁质合成酶)的活力都受激素的调控，因此，酶活力的改变，便打破了各种正常的生理进程。测试结果显示，经5种浓度Bt处理后，除48 h外，白蛾4龄幼虫体壁AChE活性间相比均无显著差异，但均有不同程度的变化，其中在处理48 h和96 h的时段AChE的活性达到高峰，处理间差异显著(P<0.01)。5种浓度处理间AChE活性的变化趋势基本一致，但处理间在36、72 、120 h时均差异不显著，说明5种浓度Bt处理对白蛾4龄幼虫体壁AChE活性无明显影响(表1)。

表1 不同浓度Bt处理白蛾4龄幼虫体壁AChE活性Tab.1 Effects of the activity of cuticle AChE on 4th instar larvae of Hyphantria cunea by different concentration of Bacillus thuringiensis treatment (mmol·min-1·g-1)

注：图中数据经邓肯氏新复极差检验法(DMRT)检验在(P<0.01)水平差异显著。

表2 不同浓度灭幼脲处理白蛾4龄幼虫体壁AChE活性Tab.2 Effects of the activity of cuticle AChE on 4th instar larvae of Hyphantria cunea by the treatment of different concentration of chlorbenzuron (mmol·min-1·g-1)

注：图中数据经邓肯氏新复极差检验法(DMRT)检验在(P<0.01)水平差异显著。

2.3.2 不同浓度灭幼脲处理对白蛾幼虫体壁AChE的影响 由表2可知，随着5种浓度灭幼脲处理后时间的增加，36～96 h时，灭幼脲对白蛾4龄幼虫体壁AChE活性有逐渐增强的趋势。5种浓度灭幼脲处理96 h时白蛾4龄幼虫体壁AChE活性到达高峰，5种浓度灭幼脲处理96 h后白蛾4龄幼虫体壁AChE活性逐渐减弱。本研究发现5种浓度灭幼脲处理后，有诱导白蛾4龄幼虫体壁AChE活性的作用，并且随着5种浓度灭幼脲处理时间的增加，白蛾4龄幼虫体壁AChE活性呈现先升高后降低的趋势。经5种浓度灭幼脲处理后，白蛾4龄幼虫体壁AChE活性变化情况不同，5种浓度Bt处理间差异显著(P<0.01)。

2.3.3 不同浓度Bt+灭幼脲混剂处理对白蛾4龄幼虫体壁AChE的影响 研究5种浓度Bt+灭幼脲混剂处理对白蛾4龄幼虫体壁AChE活性发现：各处理对白蛾4龄幼虫体壁AChE活性有诱导作用，并且随处理时间的增加白蛾4龄幼虫体壁AChE活性有先升高后降低的趋势。36～96 h时混剂处理有诱导幼虫体壁AChE活性逐渐增强的趋势，至96 h活性到达高峰，96 h后活性明显减弱，活性减低后白蛾4龄幼虫很快死亡，对AChE活性抑制率为20.13%～90.00%，处理间差异显著(P<0.01)，见表3。

表3 不同浓度Bt+灭幼脲混剂处理白蛾4龄幼虫体壁AChE活性Tab.3 Effects of the activity of cuticle AChE on 4th instar larvae of Hyphantria cunea by the treatment of different concentration of the mixture of Bt and chlorbenzuron (mmol·min-1·g-1)

注：图中数据经邓肯氏新复极差检验法(DMRT)检验在(P<0.01)水平差异显著。

3 结论与讨论

经室内外毒力测定和防治试验结果表明，Bt+灭幼脲混剂对白蛾二代、三代幼虫有较强的增效作用。许多研究表明，药剂处理后中肠蛋白酶的活力受到影响，严重时约60%的酶活力受到抑制[10],会直接影响到虫的取食，导致体重减轻，为幼虫生长发育缓慢的另一个原因。昆虫中肠蛋白酶对Bt毒力活性的大量研究结果表明，蛋白酶直接影响苏云金杆菌毒素蛋白的杀虫专一性、作用方式及抗性[11]，由于活体PuGV-Ps包涵体中碱性蛋白酶的存在，增强了Bt晶体蛋白的酶解活性，提高了Bt对小菜蛾的毒力[12]。在此基础上开展了Bt+灭幼脲混剂对白蛾4龄幼虫的几丁质酶和AChE活力的测定，结果发现,Bt+灭幼脲混剂对白蛾4龄幼虫的几丁质酶活力均有较强的抑制作用。Bade等观测到几丁质酶和几丁质之间的作用是一种动态的过程，在研究中可以从几丁质酶活力随着虫龄的变化而增加得到相应的证明，且3龄意大利蝗(Calliptamusitalicus)在蜕皮当天几丁质酶活力是2龄刚蜕皮后的近5倍[13]。昆虫蜕皮时约有90%的几丁质被降解，所以几丁质酶活力的大小将直接影响到昆虫的发育，当几丁质酶活力降低到一定程度时会导致意大利蝗蜕皮出现困难并致其死亡。从试验结果中还可以看出,绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)对昆虫几丁质酶的活力也有一定程度的抑制作用，但这种抑制作用不如化学农药显著，据此，可以采用一定的方法将绿僵菌与昆虫生长调节剂进行混配，减少药剂的使用量，以达到对意大利蝗更理想的防治效果[14]。本试验Bt+灭幼脲混剂处理对白蛾4龄幼虫体内中肠几丁质酶活力也存在影响，试验结果表明，5种浓度的Bt+灭幼脲混剂对4龄幼虫的几丁质酶活力均存在不同程度的调节作用，其中对处理6 h 时4龄幼虫体内该酶活力具有激活作用，5种浓度的Bt+灭幼脲混剂处理12 h起对4龄幼虫体内该酶活力具有明显抑制作用。Bt+灭幼脲混剂的几丁质酶活力存在显著性差异，处理白蛾4龄幼虫后，其体内的几丁质酶活力呈逐渐降低趋势。处理6 h的几丁质酶活力与同期对照有明显差异；36 h后除0.4 IU/μL+1.25 mg/L和0.2 IU/μL+0.625 mg/L外，其他各浓度处理的几丁质酶活力均低于对照，其差异极显著(P<0.01)。测定结果表明，Bt+灭幼脲混剂处理对白蛾4龄幼虫体内中肠几丁质酶活力有抑制作用，且随浓度增高和培养时间延长，抑制作用越明显。以上分析结果可知，Bt+灭幼脲混剂处理对白蛾4龄幼虫体内中肠几丁质酶活力存在先激活后抑制的作用，且抑制作用明显，当几丁质酶活力降低到一定程度时，会导致白娥4龄幼虫的死亡。

已知马拉硫磷主要作用于AChE靶标酶，使AChE活性部位磷酰化而抑制其活性，引起乙酰胆碱在突触间作用时间延长，从而引起突触后膜乙酰胆碱受体的超兴奋，使昆虫痉挛死亡[15]。赵霞等发现马拉硫磷处理48 h后，抑制了东亚飞蝗(Locustamigratoria)AChE活性，并且随着马拉硫磷浓度的升高呈现先降低后升高的趋势[16]。不同的昆虫经马拉硫磷处理后体内AChE活性变化情况不同，这可能与昆虫的处理方式和AChE活性测定方法不同有关，但对体内AChE活性的抑制被认为是最可能的结果，在马拉硫磷抗性机制研究中发现AChE活性升高是造成昆虫产生抗性的重要原因[17]。不同杀虫剂对AChE活性的抑制程度不同，其活性与杀虫剂存在明显剂量效应。其中敌敌畏对AChE活性的抑制作用最显著(LC50=3.018×10-4mg/mL)，进一步证实AChE是有机磷杀虫剂敌敌畏主要作用靶标。此外，拟除虫菊酯类(高效氯氟氰菊酯)杀虫剂对落叶松毛虫AChE活性有一定的抑制作用[18]。本研究5种浓度Bt+灭幼脲及其混剂处理对白蛾4龄幼虫体壁AChE活性有诱导作用，并且随处理时间的增加，白蛾4龄幼虫体壁AChE活性有先升高后降低的趋势，36～96 h时有诱导幼虫体壁AChE活性逐渐增强的趋势，至96 h 白蛾4龄幼虫体壁AChE活性到达高峰，96 h后白蛾4龄幼虫体壁AChE活性明显减弱，AChE活性减低后白蛾4龄幼虫很快死亡，各处理对AChE活性抑制率为20.13%～90.00%。但该结果没有机磷杀虫剂敌敌畏、拟除虫菊酯类(高效氯氟氰菊酯)杀虫剂处理对其AChE活性有明显的抑制作用[18]，本研究Bt+灭幼脲混剂处理后对白蛾4龄幼虫体壁AChE活性存在先诱导后抑制的双重作用和AChE活性被抑制后白蛾4龄幼虫很快死亡的现象，这也是Bt+灭幼脲混剂处理后白蛾4龄幼虫不出现兴奋现象和提高毒力和毒杀效果的原因。

随着美国白蛾向江苏周边地区扩散蔓延，严重威胁当地的城市绿化、林果业和养蚕业等行业的发展。Bt与灭幼脲混剂是防治该虫，具有生物控制、增效高效安全、可持续、无污染等特点，加大其产品的开发和推广运用，必将为控制美国白蛾的危害和扩散蔓延发挥重要的作用。

[1] 徐明,刘冬梅,徐福元,等. Bt+灭幼脲混剂对美国白蛾第2,3代幼虫的联合毒力及防治效果[J].林业科学,2013,49(12)：171-174.

[2] 喻子牛.苏云金杆菌[M].北京：科学出版杜,1990.

[3] 吴秋雁, 仇序佳. 灭幼脲作用机制的研究进展[J]. 应用昆虫学报, 1991(3):180-181.

[4] 刘明艳,张洪斌,胡雪芹,等. 2010.昆虫来源的几丁质酶的分离纯化及酶学性质[J].生物工程学报,1991,26(3)：404-409.[5] Fournier D, Mutero A. Modification of acetylcholinesterase as a mechanism of resistance to insecticides[J]. Comparative Biochemistry & Physiology Part C Pharmacology Toxicology & Endocrinology, 1994, 108(94):19-31.

[6] 肖拴锁,王钧. 水稻中超氧诱导与稻瘟菌抗性及苯丙氨酸解氨酶、几丁酶、β-1,3-葡聚糖酶活性诱导的关系[J].中国水稻科学,1997,11(2)：93-102.

[7] Gorun V,Proinov L,Baltescu V,et a1.Modified Ellman procedure for assay of cholinesterases in crude enzymatic preparations [J].Analytical Biochemistry,1978,86(1)：324-326.

[8] 高希武. Gorun等改进的Ellman胆碱酯酶活性测定方法介绍[J]. 应用昆虫学报, 1987(4):245-246.

[9] 岳书奎,王志英,黄玉清,等. Bt生物增效剂的研究[J].东北林业大学学报,1996,24(4)：46-50.

[10] 龚国玑,王荫长,尤子平. 灭幼脲对小地老虎、粘虫及黄粉甲幼虫内部器官和组织的作用及毒理[J].昆虫学报,1988,3l(4)：358-365.

[11] Brar S K,Verma M,Tyagi R D,et al. Bacillus thuringiensis proteases：production and role in growth,sporulation and synergism[J].Process Biochemistry,2007,42(5)：773-790.

[12] 徐健,刘琴,姚远,等.粘虫颗粒体病毒对苏云金杆菌δ-内毒素的酶解活化作用[J].植物保护学报,2008,35(3)：263-269.

[13] Bade M L,Wyatt G R. Metabolic conversions during pupation of the cecropia silkworm. 1. Deposition and utilization of nutrient reserves [J].Biochem. J.,1962,83(3)：470.

[14] 赵忠伟,曹广春,徐光青,等. 昆虫生长调节剂和绿僵菌对意大利蝗几丁质酶活力的影响[J].植物保护,2012,38(2)：83-86.

[15] 张宗炳,曹骥.害虫防治：策略与方法[M].北京：科学出版社,1990：143-154.[16] 赵霞,贾苗,王磊,等. 马拉硫磷对东亚飞蝗解毒酶活性的影响[J].环境昆虫学报,2013,35(2)：165-170.[17] Zhu K Y,Gao J R. Increased activity associated with reduced sensitivity of acetylcholinesterase in organophosphate resistant greenbug,Schizaphisgraminum(Homoptera：Aphididae) [J].Pestic Sci.1995,55(1)：11-17.

[18] 邹传山,曹传旺,王志英.落叶松毛虫AChE最佳反应体系建立及其对3种杀虫剂敏感性比较[J].北京林业大学学报,2013,35(3)：102-107.

(责任编辑 韩明跃)

Effects of the Activity of Midgut Chitinase, Cuticle AChE on 4thInstar Larvae ofHyphantriacuneaby the Treatment of Different Concentration of the Mixture of Bt and Chlorbenzuron

Xu Ming1，Xu Fuyuan1，Wu Xiaoqin2

(1. Forestry Academy of Jiangsu Province, Nanjing Jiangsu 211153, China；2. College of Forest, Nanjing Forestry University, Nanjing Jiangsu 210037, China)

Based on the indoor virulence and field control test results showed that the mixture of Bacillus thuringiensis(Bt) and chlorbenzuron had strong synergism to the second and third generation of the larvae of Hyphantria cunea. This paper analyzed the influence on the activity of midgut chitinase and cuticle AChE on the 4thinstar larvae ofHyphantriacuneathe result as following: As the concentration increased and treatment time prolonged 5 concentrations of the mixture of Bt and chlorbenzuron treated, the midgut chitinase activity of the 4thinstar larvae ofHyphantriacuneashowed inhibitory effect more obvious and got significant differences (P<0.01). It indicated that Bt+ chlorbenzuron mixture could improved the effect to the 4thinstar larvae ofHyphantriacunea. As the treatment time increased 5 concentrations of the mixture of Bt and chlorbenzuron treated, the cuticle AChE activity of the 4thinstar larvae ofHyphantriacuneaincreased first and then decreased. From 36-96 h the mixture induced the trend of the cuticle AChE activity gradually increased and treatment to 120 h the cuticle AChE activity was significantly diminished. The inhibitory rate of the cuticle AChE activity was 20.13%-90.00%. After the cuticle AChE activity decreased the 4thinstar larvae ofHyphantriacuneadied quickly (P<0.01). It was another reason of the synergistic effect of the mixture.

Hyphantriacunea；Bacillusthuringiensis；chlorbenzuron；the midgut chitinase；cuticle AChE

2015-01-19

中央财政林业科技推广示范资金项目([2014]TJS02号)资助；江苏省林业三项工程项目(lysx[2014]17)资助。

徐福元(1955—)，男，博士，研究员。研究方向：林业有害生物生物防治。Email：xufuyuan@aliyun.com。

10.11929/j.issn.2095-1914.2015.05.012

S767.3

A

2095-1914(2015)05-064-07

第1作者：徐明(1982—)，男，博士生，助理研究员。研究方向：林业有害生物生物防治。Email：xuming2009@126.com。