李海龙 吴守振 李 洺 冯晓霞

西安市第九医院(西安 70054)

红景天苷对百草枯诱发PC12细胞损伤的保护作用*

李海龙 吴守振△李 洺 冯晓霞

西安市第九医院(西安 70054)

目的：研究红景天苷保护百草枯(PQ)诱发PC12细胞损伤的作用及其机制。方法：实验分对照组、PQ诱导组、不同剂量(10μmol/L、20μmol/L、30 μmol/L)红景天苷治疗组。采用MTT法检测细胞活力，利用流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡；罗丹明123(Rh123)染色观察细胞线粒体膜电位(MMP)变化，比色法测定乳酸脱氢酶(LDH)、谷胱甘肽还原酶(GSH-PX)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性；免疫组织化学染色检测细胞色素C(CytC)的表达。结果：800 μmol/L PQ明显抑制PC12细胞增殖、诱导细胞凋亡；以不同剂量(10μmol/L、20μmol/L、30 μmol/L)红景天苷预处理后，保护了PQ所致的PC2细胞增殖抑制，降低凋亡率(P⟨0.01)。机制上，红景天苷抑制了MMP下降(P⟨0.05)，导致LDH、CytC的释放减少，增强了GSH-PX、SOD的活力(P⟨0.05)。结论：红景天苷保护了PQ诱导的细胞损伤，抑制了PQ所致的细胞凋亡，这可能与抑制CytC的释放和MMP下降，提高GSH-PX、SOD的活性有关。

红景天苷是草本植物红景天的主要化学成份之一，在抗衰老、抗疲劳、抗辐射、抗缺氧、抗肿瘤和抗病毒中具有重要作用，能够有效调节免疫力[1-4]。百草枯(paraquat，PQ)具有与多巴胺能神经毒素(1-甲基-4-苯基吡啶离子，1-Methyl-4-phenylpyridin-1-ium，MPP+)相似的结构，可诱发氧化应激，诱发细胞凋亡[5-7]，激活多种信号通路，包括TGF-β信号通路，NF-κB信号通路以及胰岛素信号通路等[8-10]。本研究将采用体外培养的PC12细胞，探讨红景天苷对PQ导致该细胞毒性损伤的影响。

1 材 料

1.1 试 剂 红景天苷购自中国药品生物制品检定所(标准对照品，批号：110818-200404)，PQ、annexinV-FITC、PI(Propidium Iodide)、MTT(3-(4，5-Dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazoliumbromide)、Rhodamine(Rh123)购自Sigma公司；DMSO、胎牛血清购自Gibco BRL公司；乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase，LDH)、超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidase，GSH-PX-Px)检测试剂盒购自南京生物工程研究所。兔抗鼠CytC单克隆抗体(mAb)购自Pharmingen公司。

1.2 细 胞 PC12细胞系由第四军医大学神经生物实验室馈赠，以含有10%胎牛血清的DMEM培养，并补充10 ng/mL神经生长因子、100 U/mL青霉素。培养细胞置于37℃、50 mL/L CO2培养箱中，待单层细胞60%～70%汇合后，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，传代培养。

2 方 法

2.1 药物处理 3×103个细胞接种于96孔板中，24 h加药处理，分组如下：对照组；PQ诱导组：不同剂量PQ组；红景天苷联合PQ诱导组：不同剂量(10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L)红景天苷预处理，24 h后加800 μmol/L PQ。各组均设3～5个平行对照组。

2.2 细胞活力测定 以3×103个细胞接种于96孔板，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，37℃下孵育4 h，去除培养液，加入150 μL DMSO，溶解结晶，测定570 nm时的吸光度(A)值。细胞活力以与对照组相比的百分数表示。

2.3 流式细胞术检测 收集各实验组细胞，以PBS冲洗2次，700 mL/L冰乙醇重悬细胞，于4℃固定24 h；1 500 r/min 4℃离心5 min；PBS洗涤2次；将细胞重悬于结合缓冲液；分别加入annexinV-FITC (10 μL)和PI(5 μL)，于4℃避光孵育30 min，进行FCM检测。

2.4 Rh123染色检测MMP 细胞爬片后，将细胞于含10 μg/mL Rh123的Hank，s液中在37℃孵育30 min；0.01 mol/L PBS(pH7.4)漂洗2次，3 min/次；以福尔马林固定45 min，于荧光显微镜下观察并拍照。

2.5 LDH活力测定 通过LDH催化乳酸生成丙酮酸的量测定LDH活力。收集各组细胞的培养液，于4℃下800 r/min离心2 min，取上清液上酶标仪以波长440 nm检测每孔的A值。

2.6 SOD、GSH-PX活力测定 利用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活力，用二硫对二硝基苯甲酸法测定GSH-PX的活力。处理各组细胞后，将细胞裂解后离心，各取100 μL细胞上清以酶标仪分别测定波长550 nm、412 nm下的A值。

2.7 PC12细胞CytC的表达 PC12细胞爬片，培养24 h，洗涤、固定、封闭，加入兔抗鼠CytC单克隆抗体(1：200)，37℃温育1 h；，PBS洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(1：100)，孵育30 min，DAB显色；然后，进行苏木素复染、乙醇脱水、二甲苯透明，封片。随机选取8个视野，计数CytC阳性细胞数，计算百分比。

3 结 果

3.1 红景天苷抑制PQ引起的PC12细胞活力下降 不同剂量(100、200、400、600、800、1000 μmol/L) PQ作用细胞，观察其对细胞活力的影响。结果表明：与对照组相比，600μmol/L、800μmol/L和1000μmol/L PQ剂量组细胞生存率明显下降(P⟨0.05，图1A)。但是，当用不同剂量(10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L)红景天苷预处理24 h，再加800 μmol/L PQ后，红景天苷有效抑制了PQ所致的PC12细胞增殖活性的下降(P⟨ 0.05)，与PQ组相比差异具有统计学意义(P⟨0.05，图1B)，这些结果表明红景天苷能够有效保护制PQ诱导的PC12细胞的损伤。

图1 红景天苷对PQ诱导的PC12细胞的损伤保护作用

3.2 红景天苷抑制PQ诱导的PC12细胞凋亡 结果显示：与对照组相比，800 μmol/L PQ明显增加促进了细胞凋亡，凋亡率为48.8%，而10 μmol/L、20 μmol/L和40 μmol/L红景天苷预处理细胞24 h后，再加800 μmol/L PQ，细胞凋亡百分率分别为33.9%、21.1%、10.8%，与其它各组比较有统计学意义(图2)，表明红景天苷可有效抑制PQ诱导的PC12细胞凋亡，且这种抑制作用具有剂量依赖性。

3.3 红景天苷抑制PQ引起的PC12细胞MMP的下降 PQ作用PC12细胞后，Rh123染色荧光强度从6.81减弱至0.78，细胞MMP显著下降(P⟨ 0.05，图3B)；加入10μmol/L、20 μmol/L和30 μmol/L红景天苷后，与PQ组相比，细胞MMP明显增加，具有显著性差异(P⟨0.05，图3C-E)，表明红景天苷有效地抑制了PQ诱导的细胞MMP下降。

3.4 红景天苷抑制PQ诱导的PC12细胞LDH活性下降 与对照组相比，800 μmol/L PQ明显增加了LDH释放量(118.55±3.88VS217.27±5.99，P⟨0.05)，而分别用10 μmol/L、20 μmol/L和30 μmol/L红景天苷预处理后，细胞LDH释放量分别为177.34±5.59、152.70±5.15和119.82±6.04，与PQ组比较，具有统计学差异，说明红景天苷降低了LDH的释放，有效保护了PQ诱导的PC12细胞的损伤(图4)。

3.5 红景天苷增强PC12细胞SOD、GSH-Px活性 与对照组比较，PQ导致PC12细胞SOD和GSH-Px活性显著下降(P⟨0.05)；10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L红景天苷能够明显提高SOD和GSH-Px的活性(P⟨0.05)，提示红景天苷对PQ减低的PC12细胞的SOD、GSH-PX的活性有明显的改善作用(图5)。

A：对照组； B：800 μmol/L PQ组； C：10 μmol/L 红景天苷 + 800 μmol/L PQ 组；D：20 μmol/L 红景天苷 + 800 μmol/L PQ 组； E：30 μmol/L 红景天苷 + 800 μmol/L 组

图2 红景天苷对PQ诱导的PC12细胞凋亡的抑制作用

图3 红景天苷抑制PQ诱导的PC12 MMP表达的下调

2.6 红景天苷抑制PQ诱导的PC12细胞CytC释放 免疫组织化学结果显示：正常组细胞形态良好，CytC均匀分布于胞质及突起内。PQ处理后细胞变圆、皱缩，CytC表达增强。红景天苷预处理后，各组中CytC的表达减少，呈弱阳性(图6)。

A：对照组； B：800 μmol/L PQ组； C：10 μmol/L 红景天苷 + 800 μmol/L PQ 组；D：20 μmol/L 红景天苷 + 800 μmol/L PQ 组； E：30 μmol/L 红景天苷 + 800 μmol/L PQ 组

图6 CytC 免疫组织化学染色结果 (400×)

4 讨 论 帕金森病(Parkinson，sdisease，PD)是一种复杂的疾病，受多种因素影响。其中，自由基对神经元的损害是帕金森致病的一个重要因素[3]。百草枯与多巴胺能神经毒素MPP+具有相似的结构，能够诱发氧化应激。红景天苷在抗衰老、抗疲劳、抗辐射、抗缺氧、抗肿瘤、抗病毒中具有重要的作用，调节机体免疫力，有效保护神经发育和损伤。本课题以PC12细胞为模型，探讨红景天苷对PQ导致该细胞毒性损伤的影响，为红景天苷治疗PD提供实验依据。

本研究中，我们以PQ成功诱导了PC12细胞的细胞毒性损伤，发现PQ能够以剂量依赖性的方式影响PC12的细胞活力，这与以往的报道一致[11]，显示PQ引发了PC12的细胞毒性损伤，其分子机制可能是抑制了PI3K/AKT信号转导通路[12]。在细胞实验中，我们选择了800 μmol/L PQ作为我们实验的作用浓度，因为这一浓度能够有效诱导PC12的细胞毒性损伤。我们的研究发现，红景天苷能够有效地抑制PQ诱导的PC12细胞的细胞活力下降。进一步，我们的实验结果表明，PQ对PC12细胞的活力影响主要是通过诱导细胞凋亡引起的，而红景天苷逆转了PQ诱导的PC12的细胞凋亡。这些结果表明，红景天苷有效地抑制PQ诱导的PC12细胞毒性损伤。

SOD、GSH-PX是机体主要抗氧化酶，能够有效清除自由基的产生。SOD、GSH-PX表达水平是神经系统衰老和损伤最为敏感和可靠的指标[13]。本研究中，我们检测了PQ对PC12细胞中LDH、SOD和GSH-PX的表达和活力的影响，我们发现PQ抑制了LDH、SOD和GSH-PX的表达和活力，进一步表明，PQ能够诱导PC12细胞的细胞毒性，并且与氧化应激有密切的关系。为此，我们研究了红景天苷对氧化应激的保护作用。我们的结果表明，红景天苷能够抑制PQ能够诱导PC12细胞的细胞毒性，恢复了LDH、SOD和GSH-PX的表达和活力。这些结果提示，红景天苷可能是通过氧化应激酶发挥神经保护作用。

线粒体膜电位的稳定性有利于维持细胞正常生理功能，为ATP的合成和线粒体摄取Ga2+提供保障[14]。线粒体也是细胞内活性氧的主要来源，但是，过多活性氧将导致正常细胞和组织的损害，引发多种疾病，如老年痴呆、帕金森病等[15]。为此，我们观察了红景天苷对PQ诱导的PC12细胞线粒体膜电位及CytC的释放的影响。实验结果表明，PQ导致了PC12细胞的线粒体细胞膜电位下降和增加了CytC的释放，提示产生了明显的细胞毒性损伤。但是，红景天苷处理后，能够有效逆转这一现象，使细胞线粒体膜电位增强，减少了CytC的释放。

因此，我们的实验结果表明红景天苷对PQ诱导的PC12细胞损伤具有保护作用，提高了细胞抗氧化能力，减少氧化应激损伤，维持了细胞线粒体正常功能，为其临床应用治疗PD提供了实验依据。

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(收稿2015-01-05；修回2015-02-21)

The protective effects of salidroside against paraquat-induced PC12 Cell line damage

The Ninth Hospital of Xi'an City (Xi’an710054)

Li Hailong Wu Shouzhen Li Min et al

Objective：To explore the neuroprotective effect and related mechanisms of Salidroside against paraquat(PQ) induced the damage in pheochromocytoma (PC12) cells. Methods：Using PQ-induced PC12 cells damage as the model of Parkinson’s disease in vitro，Cells were divided into 3 groups：control group；PQ treated group：800 μmol/L PQ treated alone；preventive groups：(10，20，30)μmol/L salidroside + 800 μmol/L PQ. the cytotoxicity of PQ was measured by MTT assay，the apoptosis of PC12 cells was detected by flow cytometry，Mitochondrial membrane potential(MMP)of PC12 cells was detected by Rh123 staining，the release of LDH and the active of SOD，GSH-PX were detected by shade selection assay，CytC immunostaining were used to detect the expresion of this protein. Results：10，20，30 μmol/L Salidroside played a protective role in the damage induced by 800 μmol/L PQ for 24 h. Salidroside significantly increased the cell viability，inhibited LDH，CytC release induced by PQ. MMP collaps in preventive groups were inhibited and the active of SOD，GSH-PX were markedly enhanced. Conclusion：Salidroside can protect cells from the necrosis and apoptosis induced by PQ，The mechanism of the protective effects of Salidroside may include increasing the activation of active of SOD，GSH-PX，inhibiting the release of CytC and MMP collapse induced by PQ．

Salidroside PC12 cells Paraquat Cenapoptosis Neuroprotective

*国家自然科学基金项目(81100001)

△西安市儿童医院(西安 710003)

红景天苷 百草枯 细胞凋亡 PC12细胞 神经保护

R966

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.07.082