张 硕， 杨 凤， 何晓峰， 张贺新， 张学全

(1.沈阳化工大学 材料科学与工程学院， 辽宁 沈阳 110142；2.中国科学院长春应用化学研究所， 吉林 长春 130022)

高效抑菌性能的聚乳酸/银纳米纤维的制备及生物特性

张 硕1， 杨 凤1， 何晓峰1， 张贺新2， 张学全2

(1.沈阳化工大学 材料科学与工程学院， 辽宁 沈阳 110142；2.中国科学院长春应用化学研究所， 吉林 长春 130022)

通过对聚乳酸和银纳米粒子的1,1,1,3,3,3-六氟代-2-丙醇(HFIP)溶液进行静电纺丝，制备具有不同银粒子浓度的聚乳酸/银纳米纤维材料，并对其进行细胞活性及抗菌性等方面的测定.研究发现:制备的聚乳酸/银纳米纤维直径分布在200～600 nm之间，银纳米粒子在纤维内分散均匀，无团聚发生，当银纳米颗粒质量分数为0.2 %时，即具备优良的抗菌杀菌性能(杀菌性>99 %)，同时纤维材料保持了良好的细胞相容性.

聚乳酸； 银纳米颗粒； 纳米纤维； 生物材料

众所周知，银粒子被广泛应用于抗菌和杀菌，具有高效、广谱的抗微生物能力，可应用于生物医用材料[1-5].银可以在细菌体外使两种微生物DNA链接，预防细菌的复制，并且可与细菌新陈代谢酶中的巯基作用，使新陈代谢酶失活.在生物医用材料领域，银可以通过溶胶-凝胶法、离子注入法、离子交换法、溅射等离子喷涂和静电纺丝法等融入聚合物中[6-11],其中静电纺丝法由于成本低廉、操作相对简便，因此，被认为是一种有效制备纳米复合纤维的技术.

以往聚合物/银粒子纤维的制备大致分为两步：首先把聚合物和硝酸银混合溶液进行静电纺丝，然后利用还原试剂把纤维中的银离子还原成单质银.徐效义[11]等通过对聚乳酸/硝酸银溶液进行静电纺丝，并利用高压氢气对硝酸银进行还原处理，制备出直径在0.27～3.41 μm之间的聚乳酸/银纳米纤维，发现其对金黄色葡萄球菌(S.aureus)和大肠埃希菌(E.coli)有抑制作用.这种制备方法可以有效避免银粒子在纤维内的团聚，但缺点是制备过程中要使用大量的硝酸银，这样势必产生细胞毒性，细胞相容性很差，制备过程由于使用氢气,存在安全隐患.

本文以获得更高效抑菌性能的纳米材料为目的,通过静电纺丝法，选择合适尺寸的银纳米粒子，结合超声技术，制备出聚乳酸/银纳米颗粒纤维，并对其进行纤维结构、细胞相容性及其在金黄色葡萄球菌和肺炎克氏杆菌中的抗菌杀菌性能测试.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

聚乳酸，特性黏度：2.0 dL/g,购于Sigma-Aldrich.1,1,1,3,3,3-六氟代-2-丙醇(HFIP)，质量分数为99 %，购于百灵威.银纳米粒子，直径<10 nm，韩国Hunion公司.

1.2 聚合物溶液的制备

将聚乳酸加入到HFIP溶剂中，质量分数为15 %，在室温下搅拌12 h直到聚乳酸全部溶解.然后将定量的银纳米颗粒加入到上述溶液中，搅拌24 h，使其混合均匀，纺丝前在超声水浴中超声20 min，使银纳米粒子均匀分散.

1.3 聚乳酸/银纳米颗粒纤维的制备

在15 kV的电压下将适量的上述聚乳酸/银纳米颗粒的溶液加入到10 mL的注射器中，注射器前端连有20 G的针头,针头与电源正极相连，注射器末端连有注射泵，在针头正前方放置有与电源负极相连并作为接收屏的铝箔，针头距接收屏15 cm，溶液推进速度为1.0 mL/h，电纺操作于室温下进行.获得的纳米纤维形貌用扫描电子显微镜(Field Emission Scanning Electron Microscope，FE-SEM,Hitachi,Japan)及透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope,TEM,Hitachi,Japan)进行观察.纤维表面透射电镜样品通过铜网直接收集后进行测试，纤维内部(断面)透射电镜样品通过将纤维包埋于环氧树脂中，然后通过切片机(Microtome)液氮冷冻进行切片.

1.4 细胞的培养

先将纤维细胞接种于培养皿中，再将质量分数为90 %的DMEM培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium,低糖，1 000 mg/L葡萄糖，L-谷氨酰胺，110 mg/L丙酮酸钠)和质量分数为10 %的优级胎牛血清(Fetal Bovine Serum)、100 U/mL盘尼西林和100 g/L 链霉素分别加入培养皿中.在37 ℃、体积分数为5 %的CO2及饱和湿度的恒温细胞培养箱中培养.细胞呈单层贴壁生长，待细胞贴壁生长覆盖面积达80 %或融合成片时即可开始实验.首先收集细胞悬液，离心，台盼蓝拒染实验计数，将1 mL细胞溶液(3×104cells/mL)加入到纳米纤维的表面并进行培养，培养4 h和72 h后进行固定化、干燥,用扫描电镜对细胞黏着进行观察.

1.5 细胞活性测定

将1 mL细胞溶液(3×104cells/mL)在纳米纤维的表面培养3 d后，每孔加入100 μL MTT 溶液(1 g/L) 继续培养4 h，弃上清,加入100 μL二甲基亚砜(DMSO)，待细胞裂解和蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)完全溶解后，用酶联免疫检测仪(ELISA)在490 nm波长处测定其吸光度，根据吸光度值大小计算反应活细胞数量.

1.6 杀菌率的测定

将准备好的菌液分别移取1 mL加在已经准备好的盛有材料试样(0.2 g)的试管中,在37 ℃ 恒温箱内培养24 h后,将对照菌液和与样品接触过的菌液各100 μL滴入到琼脂培养基上，确保菌液均匀分布后在37 ℃培养箱内培养24 h，相机拍照，通过观察培养皿内菌株数目变化确定杀菌率.

2 结果与讨论

2.1 聚乳酸/银纳米颗粒纤维表面形态

图1为含有不同银纳米颗粒浓度的聚乳酸/银纳米颗粒纤维的场发射扫描电镜图片.

图1 不同质量分数的银纳米颗粒的聚乳酸/银纳米颗粒纤维的场发射扫描电镜图片

由于银纳米颗粒具有良好的导电性，因此，制备的聚乳酸/银纳米颗粒纤维的直径随银纳米颗粒浓度的增加而变细[12-13].聚乳酸纳米纤维直径为(500±46)nm(图1(a))，当加入0.2 %(质量分数，以下同)银纳米颗粒时，纤维的直径减小到(420±37)nm(图1(c)).图2为聚乳酸/银纳米颗粒纤维(PLA/0.2 %Ag)的透射电子显微镜图片.由图2可以明显观察到银纳米颗粒均匀分布在聚乳酸纤维表面(图2(a))及内部(图 2(b)).无团聚现象的原因在于：实验中选择的银纳米颗粒尺寸较小(<10 nm)，因此，受重力影响小，在超声作用下，能够在黏度较大的纺丝溶液中较长时间均匀分布；在电场中银纳米颗粒带有相同的电荷，在排斥力的作用下，银纳米颗粒避免了在纺丝溶液中团聚，进而在纺丝后形成的纤维中得以均匀分布.

图2 银纳米颗粒(PLA/0.2 %Ag)分布在聚乳酸纤维表面及内部的透射电子显微镜图片

2.2 聚乳酸/银纳米颗粒纤维的生物相容性

理想的组织工程支架材料必须能够提供细胞的附着和生长,并且，可以抑制和杀死细菌.为了评估所制备的聚乳酸/银纳米颗粒纤维的生物相容性，将纤维细胞接种在聚乳酸/银纳米颗粒纤维上，并通过FE-SEM考察细胞在聚乳酸/银纳米颗粒纤维上的生长行为.

胚胎成纤维细胞系附着在聚乳酸、聚乳酸/0.1 %银纳米颗粒、聚乳酸/0.2 %银纳米颗粒纤维上，培养4 h，其扫描电子显微镜图片如图3所示，纤维细胞均匀地黏着在聚乳酸/银纳米颗粒纤维(图3(b)、(c))表面并开始延伸生长，与在纯PLA聚乳酸纳米纤维骨架上的细胞(图3(a))形貌几乎相同.

图3 胚胎成纤维细胞系附着在不同质量分数的银纳米颗粒的聚乳酸/银纳米颗粒纤维上的扫描电子显微镜图片(培养4 h)

从图4中可以看出：当纤维细胞在聚乳酸和聚乳酸/银纳米颗粒纤维上经过72 h的培养后，细胞会以单层形式分布在聚乳酸和聚乳酸/银纳米颗粒纤维表面.通过该结果可以得出富含银纳米颗粒的聚乳酸纳米纤维对细胞没有毒性.

图4 胚胎成纤维细胞系附着在不同质量分数的银纳米颗粒的聚乳酸/银纳米颗粒纤维上的扫描电子显微镜图片(培养72 h)

图5为聚乳酸及聚乳酸/银纳米颗粒纤维的细胞增殖72 h数据(其中450 nm为测试波长，690 nm为参比波长).

图5 聚乳酸及聚乳酸/银纳米颗粒纤维的细胞增殖72 h数据

从图5中可以看出：聚乳酸和聚乳酸/银纳米颗粒纤维的细胞活性差别较小，也表明富含银纳米颗粒的聚乳酸纳米纤维对细胞没有毒性.

2.3 聚乳酸/银纳米颗粒纤维的抗菌杀菌性

为了进一步研究聚乳酸/银纳米颗粒纤维在抗菌杀菌方面的性能，将聚乳酸及聚乳酸/银纳米颗粒纤维置于两种不同的细菌中进行测试.如图 6所示，在仅有聚乳酸存在的体系下，金黄色葡萄球菌和肺炎克氏杆菌均布满表面皿，而当含有0.1 %银纳米颗粒的聚乳酸纤维溶液所在的表面皿中仅有少量的金黄色葡萄球菌和肺炎克氏杆菌生存(杀菌率>90 %)，大多数金黄色葡萄球菌或肺炎克氏杆菌均被银纳米颗粒杀死.当银纳米颗粒质量分数为0.2 %时，表面皿中的细菌几乎全部被杀死(杀菌率>99 %)，具有高效的抗菌杀菌作用.同时，由于聚乳酸/银纳米纤维所加入的银含量较低，可有效降低制备成本.因此，聚乳酸/银纳米纤维有望成为一类优秀的生物医用材料(如伤口敷料等).

(a)、(b)、(c) 葡萄球菌 (d)、(e)、(f) 肺炎克氏杆菌

3 结 论

通过静电纺丝法制备了直径为200～600 nm的聚乳酸/银纳米颗粒纤维丝，通过测试发现银纳米粒子均匀分布在纤维表面和内部.银纳米粒子的引入，不仅保持了聚乳酸良好的细胞相容性，同时赋予了聚乳酸纤维优良的抗菌和杀菌性能，使其有望成为一类优秀的、具有工业化前景的生物医用材料.

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Preparation of Highly Efficient Antibacterial Poly(lactic acid)/Ag Nanofibers and Its Biological Properties

ZHANG Shuo1, YANG Feng1, HE Xiao-feng1, ZHANG He-xin2, ZHANG Xue-quan2

(1.Shenyang University of Chemical Technology, Shenyang 110142, China;2.Changchun Institute of Applied Chemistry Chinese Academy of Science, Changchun 130022， China)

In this research,poly(L-lactide)/Ag nanofibers containing different concentrations of Ag nanoparticles were prepared by electrospining a blend solution of poly(L-lactide) and silver nanoparticles in 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol(HFIP).The cell viability and antibacterial activity of the resultant nanofibers were investigated.According to the results,the diameter of the resulting nanofibers was in the range from 200 to 600 nm and the Ag nanoparticles were well dispersed(without aggregate).In addition,the poly(L-lactide)/Ag nanofibers exhibited excellent cell compatibility and significant antibacterial ability only containing small amount(0.2 %) of Ag nanoparticles.

poly(L-lactide); Ag nanoparticles; nanofiber; biomaterial

2013-11-06

张硕(1984-)，男，辽宁沈阳人，硕士研究生在读，主要从事高分子化学与物理方面的研究.

张贺新(1978-)，男，吉林长春人，副研究员，博士，主要从事聚烯烃、合成橡胶及静电纺丝方面的研究.

2095-2198(2015)02-0149-05

10.3969/j.issn.2095-2198.2015.02.012

O631

A