郑 琴 周 欢 熊文海 王 佳 胡鹏翼 杨 明

(江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室，南昌，330004)

芍药苷对乌头碱在Caco-2细胞模型上转运行为的影响研究

郑 琴 周 欢 熊文海 王 佳 胡鹏翼 杨 明

(江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室，南昌，330004)

目的：研究芍药苷对乌头碱在Caco-2细胞模型转运行为的影响。方法：以乌头碱累积转运量及表观渗透系数Papp值为指标，采用高效液相色谱法对乌头碱含量进行检测，考察不同浓度、不同孵育时间、不同方向乌头碱在Caco-2细胞上的转运行为，以及与芍药苷不同配伍后转运行为的变化，并考察P-gp抑制剂存在与否对乌头碱转运行为的影响。结果：乌头碱累积转运量与给药浓度、孵育时间呈正相关，不同浓度乌头碱Papp值均大于1×10-6cm·s-1，且保持恒定，无统计学意义，但外排作用明显强于吸收，外排比接近1.5。在P-gp抑制剂维拉帕米存在条件下乌头碱转运量显著增加。当乌头碱与芍药苷配伍比例为1∶60时，乌头碱转运量显著减小。结论：乌头碱为吸收良好的一类药物，以被动转运为主，但仍存在外排蛋白P-gp的参与。当芍药苷配伍乌头碱达到一定比例时，对乌头碱的肠吸收具有显著的抑制作用。

乌头碱；Caco-2细胞；芍药苷；转运；配伍；P-gp抑制剂

附子与白芍配伍最早见于汉代《伤寒杂病论》。附子辛热，性善行；白芍苦寒，酸收，附子与白芍配伍刚柔互用，一阳一阴，一热一寒，一收一散，相反相成，可缓附子辛散燥烈之偏，达到减毒的作用。附子、白芍配伍具有重要的临床价值。古人将附子、白芍配伍用于多个脏腑的病证，如脾胃虚寒、中风半身不遂、风湿骨节疼痛、血海虚寒、乳痈乳岩、久年阴寒久漏等。当代名医常将二药用于寒凝心脉之心痛；寒滞肝脉，络道癖阻，胁肋疼痛，肝脾肿大以及痛经或痹证寒湿的患者[1]。但是附子毒性较大，应用不当会产生严重的不良反应，甚至引起死亡。目前已证实，附子的毒性成分主要是双酯型乌头类生物碱[2]，其毒性产生快，可能其在胃肠道吸收好有关[3]。我们考察了白芍主要成分芍药苷对附子毒性成分乌头碱在Caco-2细胞模型中转运的影响，以期从肠道吸收角度阐明附子白芍配伍的合理性及配伍减毒机理。

1 材料与仪器

Forma 3111型二氧化碳恒温培养箱(Thermo electron corporation)，血球计数板(批号02270113，上海求精生化试剂仪器有限公司)，培养瓶(批号430639，美国costar公司)，Finnpipette F1移液器(Fisher Scientific)，1260型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，SZ-93A型自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)，3-18K型高速冷冻离心机(德国SIGMA)，3599型96孔板(美国costar公司，)，Elx800酶标仪(基因有限公司)，MERS00002跨膜电阻仪(美国millipore公司)，3460型Transwell Permeable Supports(美国costar公司，孔径0.4 μm，直径12 mm，底面积1.12 cm2)DMEM高糖培养基(SH30022.01B，美国Hyclone，)，胎牛血清FBS(生化试剂，批号10099-141，美国Gibco公司)，非必须氨基酸NEAA(生化试剂，批号11140-050，美国Gibco公司)，双抗(生化试剂，货号P1400-100，Solarbio公司)，0.25%胰酶—0.02% EDTA(批号25200-056，美国Gibco)，HBSS(H1025型，Solarbio公司)，乌头碱(HPLC﹥98%，成都瑞芬思生物科技有限公司)，芍药苷(HPLC﹥98%，成都瑞芬思生物科技有限公司)；盐酸维拉帕米(批号100223-200102，中国药品生物制品检定所)；无水乙醇(分析纯，批号20130216，天津市恒兴化学试剂制造有限公司)，碱性磷酸酶试剂盒(批号20130419，南京建成生物工程研究所)，水为双蒸水，自制。

Caco-2细胞株购自中国科学院上海生科院细胞资源中心(来源于美国典型菌种保藏中心ATCC，American Type Culture Collection)，实验中所用细胞代数为35～45代。

2 方法

2.1 色谱条件 色谱柱：Phenomenex Gemini C18，250 mm×4.60 mm；流动相：甲醇∶40 mmol/L乙酸铵(氨水调pH10)=80∶20；流速(F)：1.0 mL/min；检测波长(λ)：230 nm；柱温：30 ℃。

2.2 Caco-2单层细胞模型的建立与验证[4～7]以含10%胎牛血清，1%非必须氨基酸，1%双抗的DMEM高糖培养液。将Caco-2细胞以约1×105个/mL，每孔0.5 mL的密度接种在Transwell内培养21 d左右，前1周隔天换液，1周后每天换液。在模型建立的同时对其跨膜电阻值及碱性磷酸酶活性进行监测来判断模型是否达到转运实验要求。

2.3 MTT法考察给药浓度范围内的细胞毒性 调节细胞胞密度至1×105个/mL，每孔200 μL将细胞悬液移至96孔板内各孔(不包括周边36孔，边缘效应严重)，置于二氧化碳培养箱中培养48 h，用HBSS清洗细胞一次后加入不同药液及助溶剂1%无水乙醇，对照组加空白HBSS液，置培养箱中作用3 h，弃去药液并用HBSS液清洗细胞1次；各孔加入200 μL，0.5 mg/mL的MTT溶液；置培养箱内再作用4 h，弃去孔内的MTT，加入100 μL DMSO，溶解蓝紫色MTT-甲臜结晶，立即置酶标仪中测定在490 nm处的吸光度，每组平行6个孔。

2.4 乌头碱在Caco-2细胞上转运的研究

2.4.1 乌头碱药液的配制 精密称取置干燥器恒重的乌头碱对照品11.6 mg于100 mL棕色容量瓶中，加入1 000 μL无水乙醇涡旋至溶解，用HBSS平衡盐溶液稀释至刻度制得180 μmol/L的乌头碱药液(高浓度)，进一步用HBSS液稀释分别制得135和90 μmol/L的中浓度和低浓度乌头碱药液。

2.4.2 乌头碱在Caco-2细胞上不同浓度、不同孵育时间的转运 实验前先用37 ℃的HBSS液清洗各孔3次，最后一次置于培养箱内培养30 min，收集两侧孵育液。研究吸收时，分别向各孔AP侧加入高、中、低不同浓度药液0.5 mL，BL侧加入HBSS液1.5 mL，置于37 ℃恒温摇床中分别于15，30，45，60，90，120 min由BL侧取样0.5 mL，并在取样侧补加同温空白HBSS液0.5 mL。

2.4.3 乌头碱在Caco-2细胞上不同方向的转运 研究外排时，分别向各孔BL侧加入高、中、低不同浓度药液1.5 mL，AP侧加HBSS液0.5 mL，置于37 ℃恒温摇床中分别于15，30，45，60，90，120 min由AP侧取样0.2 mL，并在取样侧补加同温空白HBSS液0.2 mL。

2.5 芍药苷对乌头碱在Caco-2细胞上转运行为的影响研究

2.5.1 乌头碱-芍药苷配伍混合药液的配制 精密称取干燥恒重的芍药苷对照品约60 mg于10 mL棕色容量瓶中，用180 μmol/L乌头碱药液溶解并稀释至刻度，制得乌头碱-芍药苷质量比约为1∶60(由附子白芍生药常用配比1∶1折算)配伍混合药液。分别精密称取芍药苷约20、10、2、1 mg，按同样的方法分别配制得到1∶20，1∶10，1∶2和1∶1的配伍混合药液。

2.5.2 与芍药苷不同比例配伍后乌头碱转运行为研究 分别向各孔AP侧加不同比例配伍的乌头碱-芍药苷混合药液0.5 mL，BL侧加HBSS液1.5 mL，置于37 ℃恒温摇床，于120 min由BL侧取样0.5 mL进行分析。

2.6 盐酸维拉帕米对乌头碱在Caco-2细胞上转运的影响研究

2.6.1 乌头碱-盐酸维拉帕米溶液的配制 精密称取干燥恒重的盐酸维拉帕米适量，用180 μmol/L乌头碱药液溶解并稀释至刻度，制得100 μmol/L盐酸维拉帕米-180 μmol/L乌头碱药液。

2.6.2 盐酸维拉帕米对乌头碱转运行为的影响研究 向各孔AP侧加盐酸维拉帕米和乌头碱混合药液0.5 mL，BL侧加HBSS液1.5 mL，置于37 ℃恒温摇床中于120 min由BL侧取样0.5 mL进行分析。

2.7 样品的处理 样品取出后立即使用高速冷冻离心机23 469×g离心15 min，取上清液，密封后置4 ℃冰箱待分析，24 h内检测完毕。

跨膜电阻=(R样品-R空白)×膜面积

跨膜电阻即单位面积电阻值，单位为Ω·cm2；R样品为电阻仪读数，单位为Ω；R空白为Transwell内未接种细胞只加入新鲜完全培养液的测定电阻值，以实测平均值110Ω计算；膜面积为1.12 cm2。

细胞存活率=A实验组/A对照组×100%

Papp=(dQ/dt)/(A×C0)，其中Papp单位为cm·s-1,dQ/dt为单位时间药物转运量(μmol/s),A为Transwell膜面积1.12 cm2，C0为初始药物浓度(μmol/L)；

由于在每次取样后都要进行补液，对药物的浓度产生了稀释作用，因而对药物的累积转运浓度TRcum(μmol/L)进行校正：

累积转运量=TRcμm×VR；

其中Cn(μmol/L)为第n个样品浓度的测定值；Vn(mL)为第n个样品的取样体积；VR(mL)为接收侧的体积。

3 结果

3.1 方法学结果 乌头碱保留时间为6.6 min，峰形良好，空白介质、助溶剂、芍药苷及维拉帕米对乌头碱检测均无干扰，见图1；乌头碱在0.84～214 μmol/L/呈良好的线性关系，得回归方程为：Y=0.0 847X-0.2 991，R2=0.9 999；定量下限为0.84 μmol/L；准确度和精密度良好，高、中、低三个浓度6次测定的RSD值分别为4.34%、2.50%、3.98%；方法回收率为94.70%、85.55%、83.29%；样品在4 ℃下24 h内稳定。

图1 乌头碱专属性实验

注：A.乌头碱标准品HPLC图(溶剂无水乙醇);B.无水乙醇HPLC图;C.空白介质HBSS液HPLC图;D.空白HBSS液加入乌头碱对照品溶液HPLC图;E.空白HBSS液加入乌头碱及芍药苷对照品溶液HPLC图;F.乌头碱单独给药后HPLC图;G.配伍给药后HPLC图

3.2 Caco-2单层细胞模型建立与评价 本实验条件下，空白电阻值约为110Ω，在细胞接种后的前两个星期跨膜电阻值随时间推移稳步上升，15 d后趋于稳定，稳定后的跨膜电阻值大于700Ω·cm2，达到转运实验要求，见图2。Caco-2细胞单层培养至1个星期时，AP侧碱性磷酸酶的表达已是BL侧的2倍，且随培养时间推移碱性磷酸酶的极化更为明显。

图2 跨膜电阻值随培养时间变化±s，n=12)

图3 不同浓度乌头碱及溶剂(1%无水乙醇)MTT实验结果

注：1～6组分别为208、104、52、26、13和6.5 μmol·L-1乌头碱；7组为1%无水乙醇；8组为空白对照

图4 乌头碱-芍药苷不同配伍MTT实验结果±s，n=6)

注：1～5组分别为乌头碱与芍药苷1∶1、1∶2、1∶10、1∶20和1∶60配伍组,，6组为空白对照

3.3 MTT实验结果 MTT实验结果显示，助溶剂(1%无水乙醇)及各药液组细胞存活率均在95%以上，且经SPSS 19.0.0软件采用单因素方差分析，各组结果无统计学意义(P>0.05)，见图3和图4。说明无水乙醇浓度不高于1%时对细胞活性无显著影响，可用于增加难溶性双酯型乌头类生物碱在HBSS液中的溶解度；乌头碱在6.5～208 μmol/L浓度范围内，以及乌头碱与芍药苷1∶1、1∶2、1∶10、1∶20、1∶60比例配伍各组细胞存活率均在95%以上，各组结果均无统计学意义，说明各组配伍比例对Caco-2细胞的活性无显著影响，即确定可在此范围内进行Caco-2单层细胞模型的转运实验。

3.4 乌头碱在Caco-2细胞模型中转运

3.4.1 不同浓度、不同孵育时间、不同方向乌头碱在Caco-2细胞上的转运 乌头碱不同浓度、不同时间点，AP-BL和BL-AP侧累积转运量分别见图5。和图6，乌头碱表观渗透系数Papp值见表1。结果显示，乌头碱由AP-BL侧转运表观渗透系数Papp值大于1×10-6cm/s。高、中、低不同浓度乌头碱AP-BL侧累积转运量及BL-AP侧累积转运量，在120 min内随着浓度及孵育时间增加而增加；经SPSS 19.0.0软件进行统计学处理，在整个浓度范围内，表观渗透系数无统计学意义，但外排与吸收有统计学意义，外排与吸收比值接近1.5。

图5 不同浓度、不同时间点乌头碱AP-BL侧累积转运量随时间变化情况

图6 不同浓度、不同时间点乌头碱BL-AP侧累积转运量随时间变化情况

浓度(μmol·L-1)AP-BLBL-APPapp(BL-AP)/Papp(AP-BL)18010.20±0.2013.97±0.431.371359.52±0.4414.09±0.761.48909.39±0.2513.90±0.971.48

3.4.2 乌头碱-芍药苷不同比例配伍后乌头碱的转运 乌头碱与芍药苷配伍比例为1∶1、1∶2、1∶10、1∶20时，与乌头碱单独给药2 h表观渗透系数Papp值无统计学意义，而1∶60(约等于原药材1∶1配伍折算)配伍时与乌头碱单独给药2 h的转运量和表观渗透系数Papp值有统计学意义(P<0.01)，配伍后乌头碱转运量减少，表观渗透系数Papp值显著减小，说明芍药苷对乌头碱的吸收具有抑制作用，但是这种抑制作用必须当乌头碱和芍药苷配伍达到一定比例，配伍前后乌头碱转运量和表观渗透系数见表2和表3。

不同配伍比例乌头碱(nmol)1∶113.57±0.461∶213.50±0.301∶1013.53±0.411∶2013.31±0.331∶6011.60±0.25*乌头碱单独给药13.61±0.40

注：与乌头碱单独给药比较，*有统计学意义(P<0.05)，**有统计学意义(P<0.01)。

不同配伍比例乌头碱(Papp×10-6cm/s)1∶19.35±0.311∶29.30±0.211∶109.32±0.291∶209.17±0.231∶607.99±0.17**乌头碱单独给药9.38±0.27

注：**与乌头碱单独给药组比较，有统计学意义(P<0.01)。

3.4.3 盐酸维拉帕米对乌头碱在Caco-2细胞上转运的影响 乌头碱在P-gp蛋白抑制剂存在和或缺条件下在Caco-2单层细胞模型上转运表观渗透系数见表4。在120 min内，与乌头碱单独给药组相比，乌头碱+100 μmol/L维拉帕米组中乌头碱表观渗透系数Papp值有显著增加(P<0.01)。

组别表观渗透系数Papp×10-6cm/s乌头碱10.20±0.20乌头碱+100μmol/L维拉帕米13.26±0.48**

注：与乌头碱单独给药比较，*有统计学意义(P<0.05)**有统计学意义(P<0.01)。

4 讨论

目前，运用Caco-2细胞来判断药物吸收难易程度是以表观渗透系数Papp值为指标：Papp﹤10-7cm/s，吸收0～20%，难吸收；10-7cm/s﹤Papp﹤10-6 cm/s，吸收20%～70%，吸收中等；Papp﹥10-6 cm/s，吸收70%～100%，吸收良好[8]。乌头碱表观渗透系数Papp值大于1×10-6cm/s，说明乌头碱吸收良好，口服生物利用度较高。乌头碱高、中、低不同浓度乌头碱AP-BL侧累积转运量及BL-AP侧累积转运量，在120 min内随着浓度及孵育时间增加而增加，在整个浓度范围内，表观渗透系数无统计学意义，外排与吸收有统计学意义，外排与吸收比值接近1.5。且与维拉帕米合用后表观渗透系数Papp值有显著增加。乌头碱以被动转运为主，且存在外排蛋白P-gp的参与。

芍药苷能显著减小乌头碱的累积转运量，说明芍药苷对乌头碱的肠吸收具有显著的抑制作用，但是这种作用必须当芍药苷与乌头碱配伍达到达到一定比例，这也说明中药配伍比例的重要性。另有文献报道，芍药苷也为P-gp蛋白的底物，P-gp蛋白抑制剂能够增加其肠道吸收[9]。按照理论上推断，乌头类生物碱和芍药苷均为P-gp蛋白的底物，在配伍使用时应当产生竞争作用，从而产生相互促进吸收的作用。但实验结果却表明，乌头碱与芍药苷配伍使用时肠道吸收却减少。药动学研究结果表明，乌头碱与芍药苷配伍后t1/2增加，AUC减少(此部分研究结果另文发表)。这些研究结果提示，芍药苷对乌头碱肠吸收的影响是否是通过影响P-gp蛋白而产生的还有待进一步证实。

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(2015-02-02收稿 责任编辑：洪志强)

Effects of Paeoniflorin on Aconitine Transport Behavior in Caco-2 Cell Model

Zheng Qin, Zhou Huan, Xiong Wenhai, Wang Jia, Hu Pengyi, Yang Ming

(KeyLabofModernPreparationofTraditionalChineseMedicine,MinistryofEducation,JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330004,China)

Objective:To explore effects of Paeoniflorin on Aconitine transport behavior in CacCo-2 cell monolayer model. Methods: Bi-direction transport behaviors of Aconitine and effects of concentrations, incubation time on Aconitine transport behavior were studied on Caco-2 cell. The concentration of Aconitine was analyzed on a reverse-phase HPLC column, Papp value and total transport amount were calculated. The effect of P-gp inhibitor on Aconitine transport behavior was investigated as well. Results: The transport volume of Aconitine was correlated positively with the incubation time and drug concentration. There were no significant differences in the Papp value at the selected concentrations. Bi-directional transport studies on Aconitine showed that the ratio of permeability in the Basolateral to Apical direction is about 1.5 times that of the Apical to Basolateral direction. The Papp value of Aconitine was above 1×10-6cm·s-1. The transport amount of Aconitine was significantly increased in the presence of Verapamil. The transport amount of Aconitine was significantly reduced, when the ratio of Aconitine and Paeoniflorin compatibility was 1∶60. Conclusion:The results suggested that Aconitine could be easily absorbed on the Caco-2 monolayer model by a passive transportation. However, efflux protein may also play an important role in the transport process. When the compatibility of Paeoniflorin and Aconitine reached a certain percentage, intestinal absorption of Aconitine would be reduced remarkably.

Aconitine; Caco-2 Monolayer Model; Paeoniflorin; Transport Behavior; P-gp inhibitor

国家自然科学基金项目(编号：81060347)；江西省教育厅科学技术研究项目(编号：GJJ08333)

郑琴(1973—)，女，汉族，江西九江，副教授，博士，E-mail：zhengqin912006@163.com，Tel(Fax)：(0791)87118658；研究方向：中药新型给药系统设计与评价

杨明，教授，博士，Tel(Fax)：(0791)87118658；E-mail：yangming16@126.com

R944

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.03.005