孙文利 张晓旭 黄志英 陈 畅 康 琛 高 健 段飞鹏田朋朋 陈 坤 李德凤 刘玉欣 李韶菁

(1 河北大学药学院，保定，071002； 2 中国中医科学院中药研究所，北京，100700；3 中国药科大学药学院，南京，211198； 4 北京中医药大学，北京，100102)

去氢木香内酯对实验性大鼠肝损伤的保护作用

孙文利1，2张晓旭1，2黄志英2，3陈 畅2康 琛2高 健2段飞鹏4田朋朋1，2陈 坤4李德凤2刘玉欣1李韶菁2

(1 河北大学药学院，保定，071002； 2 中国中医科学院中药研究所，北京，100700；3 中国药科大学药学院，南京，211198； 4 北京中医药大学，北京，100102)

目的：研究去氢木香内酯对大鼠肝损伤模型的保护作用。方法：以氨基半乳糖、四氯化碳建立大鼠肝损伤模型，分别设正常对照组、模型组、阳性药对照组(0.2 mg/kg)、去氢木香内酯高、中、低剂量组(45 mg/kg，15 mg/kg，5 mg/kg)，测定各组大鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(Alanine Aminotransferase，ALT)、天门冬酸氨基转移酶(Aspartate Aminotransferase，AST)活性及肝组织中丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量。另以HE、Masson染色，对各组大鼠肝脏作病理检查。结果：与模型组相比，去氢木香内酯可显著降低大鼠血清ALT、AST的活性及MDA的含量(P<0.05)，减轻大鼠肝脏坏死性病理改变。结论：去氢木香内酯对大鼠肝脏损伤有较好的保护作用。

去氢木香内酯；肝损伤；氨基半乳糖；四氯化碳

肝脏疾病是人类最常见的疾病之一，其中肝损伤、肝纤维化、肝硬化是临床常见病和多发病。肝损伤是肝炎、饮酒、寄生虫导致的常见症状，肝硬化是肝损伤迁延或反复的结果，肝纤维化是肝损伤和肝硬化的桥梁[1]。

去氢木香内酯(Dehydrocostus Lactone)(结构见图1)是菊科云木香属植物木香干燥根的主要活性成分。据文献报道，其具有很好的抗癌[2]、抗菌[3-4]、抗高血酯[5]、抑制胃溃疡[6]、增加胃肠蠕动等作用[7]。本试验首次研究了去氢木香内酯对氨基半乳糖和四氯化碳肝损伤大鼠动物模型的保护作用。

1 材料与方法

1.1 动物 雄性Wistar大鼠120只，SPF级，体重220～260 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号SCXK(京)2012-0001。

图1 去氢木香内酯结构，分子式C15H18O2，分子量230.1307

1.2 药品及试剂 去氢木香内酯(纯度98%)，购自百灵威科技有限公司；阳性对照药：双环醇，北京协和药厂；秋水仙碱，北京嘉林药业股份有限公司；氨基半乳糖，北京拜尔迪生物技术有限公司；CCl4为分析级，中国北京化工厂；丙氨酸氨基转移酶(Alanine Aminotransferase，ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(Aspartate Aminotransferase，AST)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所(批号20100505)；水合氯醛，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.3 仪器 高速低温冷冻离心机(J2-21，美国Beckman Coulter公司)；酶标仪(Spectra Max M5，美国Molecular Devices公司)；全自动生化仪(7180型，日立公司)；75 mm组织匀浆器(涿州市琦瑞玻璃制品厂)。

1.4 动物分组及给药 将Wistar大鼠随机分为氨基半乳糖肝损伤组和四氯化碳肝损伤组，每组60只，每组又分为6小组，即正常对照组(Nor组，等量溶媒)、模型组(Mod组，等量溶媒)；双环醇组(0.2 mg/kg/d)，去氢木香内酯高、中、低剂量组(45，15，5 mg/kg/d)，每组10只。

1.5 模型的制备

1.5.1 氨基半乳糖肝损伤模型 除Nor组外，各组以氨基半乳糖溶液造模，8.5%腹腔注射，1 mL/100 g，同时50%乙醇灌胃，5 mL/kg，每周2次。造模后次日给药，连续7 d。

1.5.2 CCl4肝损伤模型 除Nor组外，各组以50% CCl4花生油灌胃造模，2 mL/kg，同时10%乙醇灌胃，5 mL/kg，每周2次，造模4周后给药。

1.6 指标检测 给药4周后，以水合氯醛腹腔麻醉取材，拍摄肝脏外观；腹主动脉采血后，3 000 r/min离心10 min，采用全自动生化仪测定血清ALT、AST活性。同时取肝右叶，用冰生理盐水冲洗干净，滤纸吸干，称取0.5 g，加生理盐水4.5 mL，转入预冷了的匀浆器中制成肝匀浆，用于测定肝组织中MDA含量。取左下叶肝脏，用10%中性甲醛固定，石蜡包埋、切片，HE、Masson染色观察病理变化。

2 结果

2.1 去氢木香内酯对氨基半乳糖肝损伤模型的影响 结果表明，与正常组相比，模型组ALT、AST、MDA含量显著上升(P<0.05)；与模型组相比，阳性药和去氢木香内酯可显著降低大鼠血清ALT、AST及肝组织中MDA的含量(P<0.05)，高剂量组效果最明显，以上作用有剂量依赖性。表明去氢木香内酯对氨基半乳糖肝损伤大鼠有保护作用，结果见表1。如图2所示，模型组肝脏颜色灰黄、表面颗粒密布，而给药组肝脏颜色发红，表面光滑，色泽发亮，高剂量组最明显。病理结果可见(图3)，模型组肝硬化明显，胶原纤维明显增生，出现假小叶，腹水现象严重，去氢木香内酯组大鼠肝纤维化程度明显改善，无肝萎缩和腹水现象，表明去氢木香内酯具有抗损伤、抗肝硬化，逆转肝纤维化作用。

组别剂量/mg/kgALT(U/L)AST(U/L)MDA(nmol.mg/g.pro)正常组-68.9±20.973.5±8.38.9±1.1模型组-345.7±56△△395.3±63△△11.9±2.8△△双环醇0.2197.8±70**291.4±76**10.1±1.1*去氢木香内酯5266.8±65*321.5±74*9.5±1.7*15212.6±83**293.6±80**9.4±1.4**45190.7±56**269.6±75**9.1±1.9**

注：△P<0.05，△△P<0.01 vs normal group，*P<0.05，**P<0.01 vs model group

2.2 去氢木香内酯对四氯化碳肝损伤和肝硬化模型的影响 结果表明，与正常组相比，模型组ALT、AST、MDA含量显著上升(P<0.05)；与模型组相比，阳性药和去氢木香内酯可显著降低大鼠血清ALT、AST、MDA的含量(P<0.05)，去氢木香内酯组大鼠肝纤维化程度明显改善，肝纤维化计分明显降低，以上作用有剂量依赖性。提示去氢木香内酯对肝脏纤维化和硬化大鼠有保护作用，结果见表2。模型组肝脏颜色灰黄、表面颗粒密布，而给药组肝脏颜色发红，表面光滑，色泽发亮，高剂量组最明显。病理结果可见(图4)，模型组肝硬化明显，胶原纤维明显增生，出现假小叶，有肝萎缩和腹水现象，去氢木香内酯组大鼠肝纤维化程度明显改善。

表2 去氢木香内酯对四氯化碳肝损伤和肝硬化模型的影响

注：△P<0.05，△△P<0.01 vs normal group，*P<0.05，**P<0.01 vs model group

图2 去氢木香内酯对肝损伤大鼠肝脏的影响

注：A.正常组；B.模型组；C.阳性药组；D.去氢木香内酯(5 mg/kg)组；E.去氢木香内酯(15 mg/kg)组；F.去氢木香内酯(45 mg/kg)组

图3去氢木香内酯对氨基半乳糖肝损伤大鼠的病理学影响

注：A.正常组；B.模型组；C.双环醇组；D.去氢木香内酯(5 mg/kg)组；E.去氢木香内酯(15 mg/kg)组；F.去氢木香内酯(45 mg/kg)组

3 讨论

氨基半乳糖(GaIN)肝损伤模型是经典的动物模型之一。是目前公认的比较好的研究病毒性肝炎的发病机制及有效治疗药物的实验动物模型。GaIN是一种肝细胞磷酸尿嘧啶核苷干扰剂，可造成肝弥漫性坏死和炎症，其引起的肝脏病理变化与临床病毒性肝炎相似。GaIN可以引起质膜损害，在肝细胞内形成尿苷二磷酸一半乳糖胺复合物，耗竭尿苷三磷酸，致使质膜结构蛋白质合成减少，膜出现损伤；GalN也可改变细胞内离子浓度，引起肝细胞内Ca2+增多，Mg2+减少。Ca2+增多使线粒体功能受到抑制，激活磷脂酶，加速氧化自由基产生，加剧肝细胞损伤[8]。另外GaIN还可引起肝细胞的代谢紊乱而导致肝损伤[9]。

图4 去氢木香内酯对四氯化碳肝损伤大鼠的病理学影响

注：A.正常组；B.模型组；C.秋水仙碱组；D.去氢木香内酯(5 mg/kg)组；E.去氢木香内酯(15 mg/kg)组；F.去氢木香内酯(45 mg/kg)组

CCl4在肝脏细胞微粒体内的细胞色素P450的作用下，产生自由基(三氯甲基自由基、三氯甲基过氧自由基和氯自由基)及一系列氧活性物，使细胞膜、内质网膜等发生氯烷基化和脂质过氧化，损伤膜的结构和功能，最终导致肝细胞死亡[10]。CCl4致肝损伤主要表现为血清中AST、ALT量增加和肝上皮细胞脂质过氧化或坏死，在病理上主要表现为上皮细胞肿胀、脂肪变性，继而破裂坏死，大量枯氏细胞聚集吞噬，随着损伤程度加深，肝细胞增殖减弱，胶原纤维大量堆积，形成条索状增生。

在肝组织中，ALT主要分布于细胞质内，AST主要分布于细胞质和线粒体中[11]。正常情况下，血清中ALT、AST甚少，当肝脏出现任何原因导致的肝组织损伤或细胞破坏、坏死时，酶从细胞内逸出进入血液，血清中ALT、AST含量将明显升高[12]。因此，血清ALT、AST的升高是肝损伤的重要标志，转氨酶在一定程度上反映了肝细胞损害和坏死程度[13]。与正常组比较，模型组大鼠血清中AST和ALT含量升高，肝细胞受到明显损伤；而经去氢木香内酯治疗后，各剂量组均可不同程度的降低肝损伤大鼠血清AST、ALT的升高，以上结果提示去氢木香内酯对大鼠免疫性肝损伤具有较好的保护作用。

脂质过氧化在肝损伤的发生发展过程中起重要作用。MDA脂质过氧化的最终产物自由基可诱发和增强机体内脂质过氧化作用，导致细胞膜系统损伤及其功能丧失[14]。本研究表明去氢木香内酯对肝损伤具有保护作用，其机制可能与抑制机体脂质过氧化功能有关。

实验结果显示，去氢木香内酯在降酶、抗自由基及脂质过氧化方面有明显的作用，从病理结果来看，去氢木香内酯改善了大鼠肝纤维化程度。本文首次证明了去氢木香内酯对肝损伤有一定的保护作用。

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(2014-11-15收稿 责任编辑：张文婷)

The Protective Effect of Dehydrocostus Lactone on Liver Injury in Laboratory Rats

Sun Wenli1, 2, Zhang Xiaoxu1,2, Huang Zhiying2,3, Chen Chang2,Kang Chen2, Gao Jian2, Duan Feipeng4,Tian Pengpeng1,2, Chen Kun4, Li Defeng2, Liu Yuxin1, Li Shaojing2

(1CollegeofPharmacy,HebeiUniversity,HebeiBaoding071002,China; 2ChinaInstituteofChineseMateriaMedica,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100700,China; 3CollegeofPharmacy,ChinaPharmaceuticalUniversity,JiangsuNanjing211198,China; 4BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100102,China)

Objective:To investigate the protective effect of Dehydrocostus lactone on liver injury in experimental rats. Methods: Rats were injected with galactosamine and carbon tetrachloride to induce liver injury. The model rats were randomly divided into normal group, vehicle control, positive control group (0.2 mg·kg-1), high, middle, and low Dehydrocostus lactone dose groups (45, 15 and 5 mg·kg). The changes of activity of ALT, AST in serum and MDA content in liver tissue were measured. The pathologic change of liver tissue was examined under light microscope by HE and Masson staining. Results: Compared with the vehicle group, Dehydrocostus lactone remarkably decreased (P< 0.05) the activities of ALT, AST in serum and MDA content in liver tissue. It was observed that Dehydrocostus lactone could significantly alleviate the necrotic pathologic change of liver tissue. Conclusion: Dehydrocostus lactone has protective effects on liver injury in labortary rats.

Dehydrocostus lactone; Liver injury; Galactosamine; Carbon tetrachloride

重大新药创制国家科技重大专项(编号：2012ZX09103201-055)；国家自然科学基金项目(编号：81274133，81303261)；中国中医科学院自主选题项目(编号：ZZ2014005，ZZ2014060)

孙文利(1989.12—)，女，汉，硕士研究生，药物分析专业，研究方向：药物代谢和分子药理学，E-mail：sunwenli1215@163.com

李韶菁(1974.3—)，女，汉，博士，副研究员，研究方向：中药组效关系和分子药理学研究，E-mail：shaojingli2004@126.com；刘玉欣(1956.12—)，男，汉，博士，教授，研究方向：细胞及分子药理学研究，E-mail：yuxinliu@hbu.edu.cn

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.03.025