芮海波 赵学龙 王文晓 张国花

(1 南京市中医院药剂科,南京,210001; 2 南京中医药大学,南京,210014)

HPLC法对杏桔合剂中桔梗皂苷D的含量测定研究

芮海波1赵学龙1王文晓2张国花2

(1 南京市中医院药剂科,南京,210001; 2 南京中医药大学,南京,210014)

目的:建立杏桔合剂中桔梗皂苷D的含量测定方法，为杏桔合剂的质量控制提供量化参考。方法：采用HPLC方法测定桔梗皂苷D的含量。结果：桔梗皂苷D在0.5～8 μg范围内线性关系良好，回归方程:y=238632x+10382，r=0.9997，加样回收率93.64%，RSD=1.54%。结论：应用HPLC测定杏桔合剂中桔梗皂苷D含量的方法可行，可以作为其质量控制的参考依据。

杏桔合剂；桔梗皂苷D；含量；HPLC

杏桔合剂为江苏省南京市中医院较早大量生产的浓缩剂之一,并收载于“南京市医院制剂规范”中。该方为南京市中医院所独有，经过历届医家临床使用和实践证明疗效确切。其处方由杏仁、陈皮、桔梗和甘草组成，功效为宣肺化痰。临床上广泛用于咳嗽、咽痛、咯痰不爽等。其中桔梗在宣肺化痰过程中起到很关键的作用，桔梗的主要活性成分为桔梗皂苷，桔梗皂苷D是桔梗皂苷中的主要皂苷。通过确定桔梗皂苷D的含量，为杏桔合剂质量标准的制定提供[1-10]。

1 材料与方法

1.1 仪器 Waters高效液相色谱仪(Waters 515泵,Waters 2996检测器,Waters 717进样器)；HederaODS-3 C18色谱柱(4.6 mm×200 mm,5 μm)；YP601N型电子天平(d=0.1 g)；BP211D型电子天平(精确度为十万分之一)；HH-S恒温水浴锅(江苏金坛国胜实验仪器厂)；KH-500B型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；Anke-TGL-16C型离心机(上海安亭科学仪器厂)；移液管；滴管；量筒；容量瓶等。

1.2 受试药物 桔梗皂苷D对照品(批号：111851-201102,中国食品药品检定研究院)；陈皮(批号121216,产地江苏)；甘草(批号130226,产地内蒙古)；苦杏仁(批号121223,产地江苏)；桔梗(批号130301,产地江苏)。

1.3 试剂 磷酸(色谱纯,南京化学试剂厂)；甲醇(色谱纯,江苏汉邦科技有限公司)；乙腈(色谱纯,湖北杜克化学科技有限公司)；无水乙醇(分析纯,国药集团化学试剂有限公司)；正丁醇(分析纯,国药集团化学试剂有限公司)；氯仿(分析纯,上海凌风化学试剂有限公司)；水为重蒸馏水(自制)。

2 方法

2.1 色谱条件 流动相：甲醇-乙腈-0.2%磷酸水溶液(3∶25∶72),检测波长：204 nm,柱温：25 ℃,流速：1 mL/min[11-13]。

2.2 桔梗皂苷D对照品溶液的制备 精密称取桔梗皂苷D对照品5.03 mg,置10 mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,制成每1 mL含桔梗皂苷D 0.503 mg/mL的对照品溶液[11-13]。

2.3 供试品溶液的制备 按处方量的三分之一称取各药材,按照正交实验得出的最佳工艺提取3份,将提取液浓缩至333 mL,分别加入适量的防腐剂苯甲酸钠和对羟基苯甲酸乙酯,放置4 h,抽滤。参照2010版《中华人民共和国药典》方法,取滤液20 mL,用水饱和的正丁醇振摇提取3次,每次20 mL,合并正丁醇液,用氨试液50 mL洗涤,弃去氨液,再用正丁醇饱和的水50 mL洗涤,弃去水液,正丁醇液蒸干,残渣加甲醇3 mL使溶解,加硅胶0.5 g拌匀,置水浴上蒸干,加于硅胶柱[100～120目,10 g,内径为2 cm,用三氯甲烷-甲醇(9∶1)混合溶液湿法装柱]上,以三氯甲烷-甲醇(9∶1)混合溶液50 mL洗脱,弃去洗脱液,再用三氯甲烷-甲醇-水(60∶20∶3)混合溶液100 mL洗脱,弃去洗脱液,继用三氯甲烷-甲醇-水(60∶29∶6)混合溶液100 mL洗脱,收集洗脱液,蒸干,残渣加甲醇溶解,转移至10 mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,滤过,即得[14-17]。

2.4 阴性样品溶液的制备 取方中缺桔梗的其他药材，按制剂工艺做成阴性样品，精密称取阴性样品20 mL，按供试品溶液的方法制成阴性样品溶液。

2.5 线性范围的考察 取上述配制好的桔梗皂苷D对照品分别进样1、2、4、8、16 L，以进样量(g)为横坐标，峰面积为纵坐标，求得线性方程为y=238632x+10382，R2=0.9997。因此桔梗皂苷D在0.5～8 g范围内线性关系良好[18]。(见图1)

图1 标准曲线图

2.6 专属性试验 精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各4 L，按上述色谱条件分别进行检测，色谱图如下。结果阴性样品溶液色谱中，在与对照品和样品中桔梗皂苷D相同的出峰位置无色谱峰，表明处方中其他成分对测定无干扰[19]。(见图2、3、4)

图2 桔梗皂苷D对照品

2.7 精密度试验 取2.2项下桔梗皂苷D对照品溶液，在上述色谱条件下连续进样6次，每次4 L，记录峰面积，求得RSD为0.88%[20]。(见表1)

图3 供试品溶液

图4 阴性样品溶液

序号峰面积RSD(%)160906108826008873601317460957356103386607584

由上表可知，仪器和方法的精密度良好，符合测定要求。

2.8 重复性实验 从同一份供试品中量取6份，按2.3项下制备供试品溶液，按照色谱条件分别依法测定，每份重复测定两次，每次进样10 L，记录峰面积，求得RSD为1.85%[21]。(见表2)

表2 重复性实验测定结果

上述结果表明，苦杏仁苷在该测定条件下，重复性良好。

2.9 稳定性实验 取同一份供试品，按2.3项下制备供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，12 h依法测定6次，进样10 L，记录峰面积，求得RSD为1.81%[22]。(见表3)

结果表明，供试品溶液中的苦杏仁苷在12 h内稳定，符合测定要求。

2.10 加样回收实验 精密量取6份已知桔梗皂苷D含量的样品溶液10 mL，分别加入1.263 mg/mL的桔梗皂苷D对照品溶液1 mL，按2.3项下制备供试品溶液，依法测定，重复两次，每次进样10 L，记录桔梗皂苷D峰面积，计算得桔梗皂苷D回收率在90%～110%之间(n=6)，平均回收率为93.64%，RSD为1.47%[23-24]。(见表4)

表3 稳定性实验测定结果

表4 加样回收实验测定结果

2.11 含量测定 分别从提取的3批杏桔合剂中各取2份，共6份，按2.3项下制得供试品溶液，在2.1项下进行测定，每次进样10 L，记录峰面积，带入回归方程计算样品中桔梗皂苷D的含量。(见表5)

表5 含量测定结果

3 结果

实验结果表明，本实验所采用的测定方法测定桔梗皂苷D，重现性良好，回收率较高，且在该色谱条件下，桔梗皂苷D进样精密度良好，故该法结论可靠，可作为杏桔合剂中桔梗皂苷D含量测定的方法。

4 讨论

查阅大量文献，发现桔梗皂苷D的含量测定方法基本上全采用高效液相色谱法，且多为反相色谱法，因此选用其中分离效果较好的HederaODS-3 C18色谱柱(4.6 mm×200 mm，5 μm)。

对桔梗皂苷D的含量测定是在190～400 nm波长范围内进行扫描，结果显示桔梗皂苷D在204 nm波长处有最大吸收且灵敏度最高，故选定其检测波长为204 nm。

本品的主要成分桔梗皂苷D的含量检测符合2010版《中华人民共和国药典》规定，通过确定其含量测定方法，增加了杏桔合剂质量标准中的量化指标，从而更好的保证合剂的质量可靠性。

[1]《全国中草药汇编》编写组.全国中药汇编(上)[M].北京:人民卫生出版社,1988:1865.

[2]丁东宁,谭延华,刘俊儒,等.镇原苦杏仁化学成分的研究[J].西北药学杂志,1990,5(3):21-23.

[3]邢国秀,李楠,杨美燕,等.天然苦杏仁等的研究进展[J].中成药,2003,12(12):1007-1009.

[4]杨春,卢健鸣,梁霞,等.杏仁的营养价值与开发利用[J].山西食品工业,1999,2(2):23-32.

[5]付文卫,窦德强,裴月湖.桔梗的化学成分和生物活性研究进展[J].沈阳药科大学学报,2006,23(3):184-191.

[6]吴文君,单提昆,何嘉凝,等.桔梗皂苷化学结构及药理研究进展.吉林医药学院学报,2012,33(3):176-177.

[7]孙远志,何树东.桔梗对呼吸系统疾病临床应用概况[J].内蒙古中医药,2006,12(6):58-59.

[8]张岩,刘颖,陶韵文,等.传统中药材桔梗的研究进展[J].黑龙江医药,2013,37(7):638-639.

[9]杨壮,田景奎,张琳.比色法测定桔梗中桔梗总皂苷的含量[J].中国现代应用药学杂志,2008,25(1):58-60.

[10]郭文杰,许旭东,魏建和,等.桔梗中三萜皂苷类化学研究进展[J].中国药学杂志,2008,43(11):801-803.

[11]Amagaya S,Sugishita E,Ogihara Y,et al.Comparative studies of the stereoisomers of glycyrrhetinic acid on anti inflammatory activities[J].J Pharmacobiodyn,1984,7(12):923.

[12]MatsuiS,MatsumotoH，Sonoda Y,et al.Glycyrrhizin and related compounds down-regμLate production of inflammatory chemokines IL-8 and eotaxin 1 in a human lung fibroblast cell line[J].Int Immunopharmacol,2004，4(13):1633.

[13]Zhang W,Lu C,Liu Z,et al.Therapeutic effect of combined triptolide and glycyrrhizin treatment on rats with collagen induced arthritis[J].PlantaMed,2007,73(4):336.

[14]吴碧元,孙军,蒋红芳.桔梗提取工艺的研究[J].中药材,2002,25(6):430-432.

[15]上海药物研究所.中草药有效成分的提取和分离[M].上海:上海人民出版社,1972:284.

[16]郭丽,肖永庆,张村,等.桔梗药材中桔梗皂苷D的定性定量方法研究[J].北京中医药大学学报,2007,30(3):200-204.

[17]潘鹏翔.川杏合剂薄层色谱鉴别研究[J].亚太传统医药，2012,8(6):46-47.

[18]李洪燕,张蕊,冯晓川.HPLC-ELSD法测定复方枇杷止咳颗粒中桔梗皂苷D、熊果酸、齐墩果酸和贝母素甲[J].中成药,2013,35(7):1479-1480.

[19]彭善贵,文永盛.HPLC-ELSD法测定桔梗冬花片中桔梗皂苷D的含量[J].中国药师,2012,15(1):134-135.

[20]丁大勇,高菲,姚琳,等.HPLC-ELSD法测定桑菊感冒片中桔梗皂D的含量[J].中国中医药信息杂志,2012,19(3):54-55.

[21]李喜凤,杜云锋,谢新年,等.不同产地桔梗药材HPLC指纹图谱及桔梗皂苷D含量测定研究[J].中成药,2010,32(4):529-530.

[22]曲建启,潘西芬,李以菊.高效液相法测定婴儿止咳合剂中桔梗皂苷D的含量[J].中国实验方剂学杂志,2012,18(23):130-131.

[23]笔雪艳,刘晓凤,张清波,等. 桔梗药材及饮片的质量标准研究[J].中医药信息,2011,28(6):69-70.

[24]李俏阳.用HPLC法测定桔梗流浸膏中桔梗皂苦D含量的效果分析[J].求医问药,2013,11(8):268-269.

(2014-06-16收稿 责任编辑：张文婷)

HPLC Method for Determination of Platycodin D in Apricot Orange Mixture

Rui Haibo1, Zhao Xuelong2, Wang Wenxiao2, Zhang Guohua2

(1ChineseHospitalofNanjing,Nanjing210001,China; 2NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210014,China)

Objective:To establish content determination method of platycodin D in apricot orange mixture so as to provide quantitative information for quality control of apricot orange mixture.Methods:HPLC was used to determine contents of platycodin D.Results:Platycodin D in the range 0.5 ～ 8ug had good linear relationship, and the regression equation was: y=238632x +10382, r=0.9997, recovery was 93.64%,RSD=1.54%.Conclusion:The method of HPLC to determine Platycodin D in apricot orange mixture is feasible, and it can be used as a reference for its quality control.

Apricot orange mixture; Platycodin D; Content; HPLC

南京市中医院青年科研基金课题(编号：2011YJ006)

芮海波，男，主管中药师，主要从事医院制剂质量标准研究，E-mail：157854957@qq.com

R284.1；R-331

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.06.027