唐富波　白晓东　胡 森

(1．解放军总医院第一附属医院全军创伤修复与组织再生重点实验室暨皮肤损伤修复与组织再生北京市重点实验室，北京 100048；2. 武警总医院烧伤整形科，北京 100039)

综述

烧伤对血管内皮细胞屏障的影响及其保护药物的研究进展

唐富波1,2白晓东2胡 森1

(1．解放军总医院第一附属医院全军创伤修复与组织再生重点实验室暨皮肤损伤修复与组织再生北京市重点实验室，北京 100048；2. 武警总医院烧伤整形科，北京 100039)

血管内皮细胞屏障的完整性对于维持体内循环平衡和各脏器生理功能至关重要。烧伤后，毛细血管扩张、血管通透性增加，体液渗出，引起组织、器官水肿和功能障碍。保护烧伤后血管内皮细胞屏障，减轻烧伤后损伤，是长期以来烧伤的研究重点。本文就近年来烧伤对血管内皮细胞屏障的影响及机制、血管内皮细胞屏障的保护药物研究进展综述如下。

1　血管内皮细胞屏障与烧伤

1.1血管内皮细胞屏障血管内皮是由一层紧密连接的内皮细胞单层和基膜构成的半选择性通透屏障，控制血液和组织之间的体液、蛋白质、电解质交换[1]。这一屏障的破坏可以直接引起血管内皮通透性增加。血管内皮细胞屏障功能与细胞骨架蛋白、细胞间连接、基底膜等关系密切。

内皮细胞骨架蛋白对于维持细胞正常形态起关键作用。它由微丝、微管、中间丝等成分组成[2]。微丝的主要组成成分是肌动蛋白（actin）、肌球蛋白（myosin）和肌动蛋白结合蛋白（actin-binding protein），其中以肌动蛋白的量最大[3]。在这些结构中,肌动蛋白对调节血管内皮细胞屏障功能具有重要作用。各种炎症介质诱导肌球蛋白轻链（MLC）的磷酸化和内皮细胞骨架蛋白的收缩,导致细胞向心张力增加和细胞间黏附减弱，使细胞间的间隙形成，细胞间通透性增加[4]。

细胞间连接包括紧密连接、缝隙连接、黏附连接等[2]。紧密连接（tight junctions）是细胞屏障的重要组成部分，只存在于内皮细胞间，环绕整个细胞形成闭锁小带或闭锁斑。细胞通透性的调节主要通过紧密连接蛋白连接复合物与胞内肌动蛋白骨架的相互作用来实现[5]。黏附连接存在于内皮细胞间、内皮细胞和基底膜之间。黏附连接是由具有钙依赖的血管内皮钙黏着蛋白(VE-cadherin, VE-cad)和胞浆内的黏附蛋白形成的特异性复合体[6]。基底膜的主要成分为胶原蛋白、纤维连接蛋白、层黏连蛋白等，大分子物质通过基底膜进出血管[7]。内皮细胞与基底膜间的黏附由整合素及相关蛋白介导，形成附着斑。整合素的胞外N末端与细胞外基质（extracellular matrix，ECM）相连，胞内C末端通过尾蛋白、α辅肌动蛋白等与骨架蛋白连接[3]。

1.2烧伤对血管内皮细胞屏障的影响及机制烧伤后，机体受到严重的致伤因子打击，产生强烈持久的应激反应，同时组织的缺血缺氧、再灌注损伤、烧伤毒素、内毒素、炎性介质、内环境紊乱、免疫损伤等多种因素的作用，导致血管内皮细胞的破坏、内皮细胞间隙增宽等，引起血管内皮细胞屏障的破坏。近年来研究发现，一些信号途径或分子参与烧伤后血管内皮细胞屏障功能障碍的过程。

1.2.1肌球蛋白轻链激酶（MLCK）与肌球蛋白轻链（MLC）途径MLCK的磷酸化调节内皮细胞通透性，MLCK 通过磷酸化MLC的第18位丝氨酸和第19位苏氨酸激活肌球蛋白重链头部ATP 酶，产生的能量引起内皮细胞肌动蛋白与肌球蛋白Ⅱ相互作用，使细胞收缩，细胞间隙形成，通透性增加[8]。MLCK在肠道内皮屏障功能调节中起着重要作用。MLCK的磷酸化引起肌动蛋白丝与肠上皮细胞紧密连接相关蛋白和肌动蛋白纤维的破坏，导致紧密连接中断，从而影响内皮细胞屏障通透性[9]。MLCK的激活也导致其他关键紧密连接蛋白如咬合蛋白（occludin）和带状闭合蛋白-1（ZO-1）等的降解，从而影响内皮细胞通透性[10]。Tinsley等[11]的实验显示，烧伤血清刺激肺微血管内皮能诱导MLC的磷酸化，并伴随血管内皮通透性增高；同时，MLCK抑制剂可减少MLC磷酸化，能降低烧伤血清诱导的内皮细胞通透性增高。Reynoso等[12]在小鼠烫伤实验中发现，与含MLCK-210基因的烫伤小鼠比较，敲除MLCK-210基因的烫伤小鼠血管通透性显著降低，其生存率也得到明显改善。Guo等[13]敲除小鼠的非肌肌球蛋白轻链(nonmuscle myosin light chain kinase，nmMLCK)后进行烧伤实验，发现其中性粒细胞黏附受到抑制，肠旁渗漏明显减少，烧伤后的肠道血管内皮细胞屏障功能得到了保护。

1.2.2p38/MAPK途径丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，作为高度保守的真核细胞内信号转导通路，可以被广泛的细胞外信号或刺激所激活[14]。MAPK包括细胞外信号调节激酶、p38激酶和c-Jun氨基末端激酶3种成员[15]。研究表明，p38激酶是烧伤后引起炎症反应和细胞凋亡的重要途径。p38激酶参与烧伤后血管内皮细胞应力纤维形成和ZO-1的解离和内化，抑制p38激酶能逆转烧伤后内皮细胞屏障功能紊乱[3]。

1.2.3其他信号通路Toll样受体(Toll-like receptors，TLR)与烧伤后血管内皮细胞屏障功能障碍有关。TLR是机体免疫反应的重要因子，其中TLR-4主要识别革兰阴性菌的内毒素（LPS）。Murphy等[16]的研究表明，烧伤后大鼠TLR-4表达增强，在LPS的诱导下死亡率增高。Breslin等[17]在实验中，使野生型小鼠和TLR-4基因缺失型小鼠接受25%TBSA烫伤，野生型小鼠血管通透性和白细胞黏附数量明显高于TLR-4基因缺失型小鼠，表明TLR-4在非脓毒症的烧伤炎症条件下，对于微血管通透性及白细胞黏附起重要调节作用。Peterson等[18]观察到，TLR-4基因缺失小鼠在烫伤后较正常小鼠烫伤后肠道通透性减弱，渗透性降低，肠屏障功能破坏减少，说明肠屏障的损伤具有TLR-4依赖性。Krzyzaniak等[19]在烧伤实验中将敲除TLR-4基因的小鼠与正常基因组的小鼠进行比较，证实了烧伤介导的小鼠急性肺损伤是一个TLR-4依赖性过程，烧伤后缺乏TLR-4基因的小鼠肺血管通透性和肺损伤明显轻于烧伤后的正常对照小鼠。

近年来的研究也证实，Rho蛋白是内皮细胞屏障功能的重要调节因子。Rho蛋白通过影响细胞内以肌球蛋白为主的收缩成分和内皮间连接的功能，调节内皮细胞屏障的通透性[20]。Zheng等[21]研究发现，Rho特异性抑制剂能够抑制烧伤后细胞骨架蛋白的破坏，降低内皮通透性，保护内皮细胞屏障功能。

Tinsley等[22]的研究表明，蛋白激酶C(PKC)参与了烧伤后肺血管内皮细胞黏附连接（AJ）的重组和血管内皮细胞屏障的功能调节。烧伤血清刺激血管内皮细胞，导致VE-钙黏蛋白或β-连环蛋白的丝氨酸磷酸化，从而使细胞间隙增宽，内皮通透性增加。

2　药物对烧伤后血管内皮细胞屏障的保护作用

随着对烧伤血管内皮细胞屏障研究的逐步深入，研究发现，某些药物对上述通路具有直接或间接的作用，可以减少血管通透性，保护血管内皮细胞屏障功能。

2.1MLCK/MLC途径药物MLC磷酸化导致血管内皮细胞收缩和细胞间隙增宽，通透性增加，使血管内皮细胞屏障遭到破坏。减少MLC磷酸化，可以减轻内皮细胞屏障的损伤。Costantini等[23]发现，己酮可可碱可以通过抑制大鼠烧伤后MLCK水平的增高，减少MLC的磷酸化，从而降低烧伤引起的肠道微血管内皮通透性增加，对肠道血管内皮细胞屏障具有一定的保护作用。Zahs等[24]在小鼠烧伤后给予MLCK抑制剂PIK（peptide inhibitor of myosin light chain kinase），可以减少肠道炎症细胞浸润，减少肠旁渗漏，保护肠道微血管内皮细胞屏障功能。Chen等[25]在实验中给予烧伤小鼠MLCK特异性抑制剂ML-9，结果减轻了烧伤后肠道通透性的增加和肠黏膜损伤，减少了紧密连接蛋白的降解，降低了MLC磷酸化，保护了肠道血管内皮细胞屏障功能。Cao[26]等发现，小檗碱通过抑制低氧诱导因子-1α（HIF-1α），减少了MLCK介导的MLC磷酸化，对肠上皮屏障功起到了一定的保护作用。Luo等[27]发现，组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸钠可以抑制HIF-1α，减少血管内皮生长因子（VEGF）和MLCK的表达，减少MLC磷酸化水平和紧密连接间带状闭合蛋白ZO-1的降解，保护烧伤后动物模型肠道血管内皮细胞屏障功能。

2.2p38/MAPK途径药物p38/MAPK作为影响内皮细胞屏障的另一重要途径，也是研究保护烧伤血管内皮细胞屏障的一大热点。使用p38MAPK抑制剂SB202190的烧伤小鼠与不使用SB202190的烧伤小鼠比较，肺水肿形成和肺微血管损伤可以显著减轻[28]。Costantini等[29]给烧伤小鼠腹腔注射p38MAPK抑制剂SB203580，从而减少了肠道微血管内皮细胞通透性，保护了肠屏障功能。他们还证明，使用己酮可可碱可以抑制烧伤小鼠的p38MAPK磷酸化，维持肠屏障的稳定性，并可减轻肺血管通透性，减轻急性肺损伤[30]。

2.3其他保护药物对体外培养的烧伤早期内皮细胞使用Rho蛋白特异性抑制剂Y-27632后，可以使F肌动蛋白的分布逐渐恢复到正常水平，减轻细胞间隙的形成，保护血管内皮细胞屏障功能。对游离的烧伤皮肤微血管使用Y-27632，血管内皮通透性明显降低，也起到保护血管内皮细胞屏障功能的作用[20]。使用Rho激酶抑制剂法舒地尔(fasudil)可以降低失血性休克动物模型内皮细胞和白细胞的相互作用，减少白细胞浸润，减少血管炎症反应，保护血管内皮细胞屏障功能[31]。Tinsley等[22]在烧伤实验中使用蛋白激酶C特异性抑制剂双吲哚基顺丁烯二酰亚胺(bisindolylmaleimide)，可以抑制烧伤后血管内皮细胞VE-钙黏蛋白和β-连环蛋白的丝氨酸磷酸化水平，保护血管内皮通透性。

3　展 望

机体在烧伤后受到严重致伤因子打击，产生强烈应激反应，高温、缺血缺氧、毒素、各种炎症因子等使血管内皮通透性增高，血管内皮细胞屏障破坏，引起体液外渗、组织水肿，造成机体循环血量下降，形成低血容量性休克，各脏器缺血、灌注不足，最终造成多器官功能障碍。因此，保护血管内皮细胞屏障功能，对于防治烧伤休克和维持脏器功能、提高烧伤救治的成功率具有重要意义。近年来，研究者们对烧伤后血管内皮细胞屏障功能障碍的分子机制进行了深入研究，发现了许多血管内皮细胞屏障功能调节的作用靶点，为实验研究提供十分广阔的研究空间。研究调节血管内皮细胞屏障功能的药物，可以保护血管内皮细胞屏障，为不同条件下烧伤救治提供更多的选择和思路。

［1］Goddard LM, Iruela-Arispe ML. Cellular and molecular regulation of vascular permeability[J]. Thromb Haemost, 2013, 109(3)∶ 407-415.

［2］Dejana E. Endothelial cell-cell junctions∶ happy together[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2004, 5(4)∶ 261-270.

［3］张家平, 黄跃生, 汪仕良. 烧伤后早期血管通透性增高研究进展[J]. 中华烧伤杂志, 2010, 26(5)∶ 343-346.

［4］Shen Q, Wu MH, Yuan SY. Endothelial contractile cytoskeleton and microvascular permeability[J]. Cell Health Cytoskelet, 2009,7(1)∶ 43-50.

［5］Steed E, Balda MS, Matter K. Dynamics and functions of tight junctions[J]. Trends Cell Biol, 2010, 20(3)∶ 142-149.

［6］张庆芝, 闵锐. 血管内皮通透性调节机制新进展[J]. 中国微循环, 2009, 13(6)∶585-588.

［7］Yurchenco PD, Patton BL. Developmental and pathogenic mechanisms of basement membrane assembly[J]. Curr Pharm Des, 2009, 15(12)∶ 1277-1294.

［8］吴洁, 张伟金, 黄巧冰. 肌球蛋白轻链激酶介导内皮细胞屏障功能变化的研究进展[J]. 中国病理生理杂志, 2015, 31(3)∶ 572-576.

［9］Costantini TW, Loomis WH, Putnam JG, Kroll L, Eliceiri BP, Baird A, Bansal V, Coimbra R. Pentoxifylline modulates intestinal tight junction signaling after burn injury∶ effects on myosin light chain kinase[J]. J Trauma, 2009, 66(1)∶ 17-24; discussion 24-25.

［10］Shen L, Black ED, Witkowski ED, Lencer WI, Guerriero V, Schneeberger EE, Turner JR. Myosin light chain phosphorylation regulates barrier function by remodeling tight junction structure[J]. J Cell Sci, 2006, 119(Pt 10)∶ 2095-2106.

［11］Tinsley JH, Teasdale NR, Yuan SY. Myosin light chain phosphorylation and pulmonary endothelial cell hyperpermeability in burns[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2004, 286(4)∶ L841-L847.

［12］Reynoso R, Perrin RM, Breslin JW, Daines DA, Watson KD, Watterson DM, Wu MH, Yuan S. A role for long chain myosin light chain kinase (MLCK-210) in microvascular hyperpermeability during severe burns[J]. Shock, 2007, 28(5)∶589-595.

［13］Guo M, Yuan SY, Frederich BJ, Sun C, Shen Q, McLean DL, Wu MH. Role of non-muscle myosin light chain kinase in neutrophil-mediated intestinal barrier dysfunction during thermal injury[J]. Shock, 2012, 38(4)∶ 436-443.

［14］张奇, 白晓东, 付小兵. p38MAPK信号通路研究进展[J]. 感染、炎症、修复, 2005, 6(2)∶121-123.

［15］Goldsmith CS, Bell-Pedersen D. Diverse roles for MAPK signaling in circadian clocks[J]. Adv Genet, 2013, 84∶ 1-39.

［16］Murphy TJ, Paterson HM, Kriynovich S, Zang Y, Kurt-Jones EA, Mannick JA, Lederer JA. Linking the "two-hit" response following injury to enhanced TLR4 reactivity[J]. J Leukoc Biol, 2005, 77(1)∶ 16-23.

［17］Breslin JW, Wu MH, Guo M, Reynoso R, Yuan SY. Toll-like receptor 4 contributes to microvascular inflammation and barrier dysfunction in thermal injury[J]. Shock, 2008, 29(3)∶349-355.

［18］Peterson CY, Costantini TW, Loomis WH, Putnam JG, Wolf P, Bansal V, Eliceiri BP, Baird A, Coimbra R. Toll-like receptor-4 mediates intestinal barrier breakdown after thermal injury[J]. Surg Infect (Larchmt), 2010, 11(2)∶ 137-144.

［19］Krzyzaniak M, Cheadle G, Peterson C, Loomis W, Putnam J, Wolf P, Baird A, Eliceiri B, Bansal V, Coimbra R. Burn-induced acute lung injury requires a functional Toll-like receptor 4[J]. Shock, 2011, 36(1)∶ 24-29.

［20］黄巧冰. 内皮细胞屏障与烧伤后血管通透性的关系及机制[J].中华烧伤杂志,2007,23(5)∶ 324-326.

［21］Zheng HZ, Zhao KS, Zhou BY, Huang QB. Role of Rho kinase and actin filament in the increased vascular permeability of skin venules in rats after scalding[J]. Burns, 2003, 29(8)∶ 820-827.

［22］Tinsley JH, Breslin JW, Teasdale NR, Yuan SY. PKC-dependent, burn-induced adherens junction reorganization and barrier dysfunction in pulmonary microvascular endothelial cells[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2005, 289(2)∶ L217-L223.

［23］Costantini TW, Loomis WH, Putnam JG, Kroll L, Eliceiri BP, Baird A, Bansal V, Coimbra R. Pentoxifylline modulates intestinal tight junction signaling after burn injury∶ effects on myosin light chain kinase[J]. J Trauma, 2009, 66(1)∶ 17-24; discussion 24-25.

［24］Zahs A, Bird MD, Ramirez L, Turner JR, Choudhry MA, Kovacs EJ. Inhibition of long myosin light-chain kinase activation alleviates intestinal damage after binge ethanol exposure and burn injury[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2012, 303(6)∶ G705-G712.

［25］Chen C, Wang P, Su Q, Wang S, Wang F. Myosin light chain kinase mediates intestinal barrier disruption following burn injury[J]. PLoS One, 2012, 7(4)∶ e34946.

［26］Cao M, Wang P, Sun C, He W, Wang F. Amelioration of IFN-gamma and TNF-alpha-induced intestinal epithelial barrier dysfunction by berberine via suppression of MLCK-MLC phosphorylation signaling pathway[J]. PLoS One, 2013, 8(5)∶ e61944.

［27］Luo HM, Du MH, Lin ZL, Zhang L, Ma L, Wang H, Yu W, Lv Y, Lu JY, Pi YL, Hu S, Sheng ZY. Valproic acid treatment inhibits hypoxia-inducible factor 1alpha accumulation and protects against burn-induced gut barrier dysfunction in a rodent model[J]. PLoS One, 2013, 8(10)∶ e77523.

［28］Ipaktchi K, Mattar A, Niederbichler AD, Hoesel LM, Vollmannshauser S, Hemmila MR, Su GL, Remick DG, Wang SC, Arbabi S. Attenuating burn wound inflammatory signaling reduces systemic inflammation and acute lung injury[J]. J Immunol, 2006, 177(11)∶ 8065-8071.

［29］Costantini TW, Peterson CY, Kroll L, Loomis WH, Eliceiri BP, Baird A, Bansal V, Coimbra R. Role of p38 MAPK in burninduced intestinal barrier breakdown[J]. J Surg Res, 2009, 156(1)∶ 64-69.

［30］Costantini TW, Peterson CY, Kroll L, Loomis WH, Putnam JG, Wolf P, Eliceiri BP, Baird A, Bansal V, Coimbra R. Burns, inflammation, and intestinal injury∶ protective effects of an antiinflammatory resuscitation strategy[J]. J Trauma, 2009, 67(6)∶1162-1168.

［31］Wang QM, Stalker TJ, Gong Y, Rikitake Y, Scalia R, Liao JK. Inhibition of Rho-kinase attenuates endothelial-leukocyte interaction during ischemia-reperfusion injury[J]. Vasc Med, 2012, 17(6)∶ 379-385.

10. 3969/j. issn. 1672-8521. 2015. 04. 013

国家自然科学基金面上项目（81471872）；国家发改委卫星示范专项[发改办高技(2013)2140号]

胡森，研究员（E-mail∶bs0425@163.com）

2015-07-10)