王冠勋，李正强，尤 琦，李佳乐，王梓霖，韩 冰

(吉林大学口腔医学院口腔颌面外科，吉林 长春 130021)

唾液作为口腔癌症诊断的研究进展

王冠勋，李正强，尤 琦，李佳乐，王梓霖，韩 冰

(吉林大学口腔医学院口腔颌面外科，吉林 长春 130021)

利用唾液进行疾病的诊断和检测是一种很有前景的方法，在过去的20年里，学者们将唾液生物标记物作为口腔癌症早期诊断方法，并找到了超过100种的唾液生物标记物，但仍存在一些问题需要进一步研究。本文对唾液生物标记物作为口腔癌症(口腔鳞状细胞癌)诊断的研究进展做一综述。

口腔癌；唾液；生物标记物

口腔癌是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤，其发病率为3%，在全身癌症中排名第六，5年存活率为62%，90%的口腔癌属于上皮源性的鳞状细胞癌(Oral squamous cell carcinoma，OSCC)[1]。大多数OSCC发病后在口腔内可以找到明显的癌变组织，但是由于各种原因往往确诊时病程已经进入了晚期阶段(T3-T4)，严重影响了口腔癌的预后。学者们通过研究发现，唾液中含有许多成分可以反映出病理状态下的人类代谢水平，唾液中的生物标记物可以作为早期诊断OSCC的依据[2-3]。目前在唾液中已经发现了100多种可能作为诊断OSCC的潜在生物标记物[4]。本文旨在通过回顾目前相关领域的研究进展，对唾液生物标记物作为口腔癌症(口腔鳞状细胞癌)的诊断研究进行探讨。

1 唾液的成分及功能

唾液是由腮腺、颌下腺、舌下腺及许多小黏液腺分泌的，pH值为6.4～7.4，其成分包括水、无机盐、有机物、蛋白、激素等。唾液具有润滑黏膜、消化食物、抗菌活性、牙釉质的再矿化和维护正常的味觉等功能[5-6]。目前在唾液中已发现2 300多种蛋白质和多肽，其中含量较多的蛋白质是α-淀粉酶、白蛋白、半胱氨酸蛋白酶、IgA、乳铁蛋白、粘蛋白、溶菌酶等，其中富酪蛋白和转铁蛋白占唾液总蛋白的98%[7-8]。

2 口腔癌患者唾液中的生物标记物及其研究方法

与其他恶性肿瘤相比，唾液可以直接接触到OSCC的病灶部位，因此唾液中的生物标记物成为了首选的诊断口腔癌症的生物样品来源。在以往的研究中，学者们证实OSCC患者唾液中的DNA、mRNA、酶、细胞因子、生长因子、基质金属蛋白酶、端粒酶、细胞角蛋白等已发生改变[9]。Liao等[10]在2000年首先提出了唾液对口腔癌症的诊断意义，62.5%的口腔癌患者唾液中的DNA外显子4和p53基因第63位密码子发生突变，在患者的血清中还检测到了基因突变后表达异常的p53蛋白经体液免疫产生的相应抗体，同时在口腔癌患者的基因中存在着杂合性丢失(Loss of heterozygosity，LOH)，且LOH的发生率普遍高于基因突变的发生率。

Bahar等[11]研究发现，与健康人相比OSCC患者唾液中活性氮的含量显著增高，而唾液中抗氧化剂则显著降低。增高的活性氮直接导致了唾液中抗氧化剂的减少，使蛋白和DNA氧化并导致癌症。Sato等[12]研究发现OSCC患者唾液中白细胞介素(IL-6)与肿瘤坏死因子(TNF-α)显著增高，IL-6能抑制p53肿瘤抑制基因的启动子区使其失活，导致细胞的增殖与凋亡失去控制；TNF-α则激活NFjB转录因子增殖，阻止细胞凋亡并促进炎性细胞因子的分泌。Zhong等[13]研究发现在OSCC患者唾液中有75%的端粒酶表达，认为人类端粒酶逆转录酶(hTERT)可能是一个潜在的生物标记物，端粒酶是由核糖核蛋白在其编码染色体末端增加重复序列编码而来，端粒酶的活化可能导致正常细胞向恶性细胞的转变。

口腔癌中存在的细胞、分子异质性以及大量潜在的致癌基因足以说明了运用蛋白质组学研究其基因表达变化的重要性。随着基因组学和蛋白质组学的不断发展以及质谱技术的提出，口腔癌患者唾液中生物标记物的鉴别也得到了进一步的发展。Carvalho等[14]通过免疫方法成功的从唾液中提出了5种可能的生物标记物：Mac-2结合蛋白(M2BP)、髓系相关蛋白质14(MRP14)、CD59、前纤维蛋白1和过氧化氢酶。蛋白质组学定量分析技术发现，在癌症患者唾液样本中肌动蛋白和肌凝蛋白的含量均高于正常人水平[15]，并证实二者就是唾液中的生物标记物[16]。而转铁蛋白及肿瘤特异性DNA也可能成为口腔癌早期诊断中有效的生物标记物。有文献指出了唾液中的一些mRNA可作为口腔癌生物标记物，包括双特异性磷酸酶1(DUSP1)、编码组蛋白H3F3A、IL-1B、IL-8、鸟氨酸脱羧酶抗酶I(OAZ1)、亚精胺/精胺N1-乙酰转移酶1(SAT)、S100钙结合蛋白P(S100P)等。Zhong等[17]也鉴定出了一些生物标记物，包括4个转录子组(IL-8、IL-1B、SAT1、S100P)和3种蛋白(IL-1B、IL-8、M2BP)，这些物质在癌症患者唾液中的含量明显高于正常人。学者们对基因多态性进行研究发现，IL-6、IL-8、TNF-α、血管内皮生长因子(VEGF)、细胞色素p4501A1(CYP1A1)、谷胱甘肽S-转移酶T1(GSTT1)、谷胱甘肽S-转移酶M1(GSTM1)与癌症的进展有关[18]。唾液中含有大量的基因组信息，且较传统的分析物如血液、病变组织更方便易得，因此唾液将有望成为口腔癌症基因筛选的有利途径。

3 OSCC患者唾液中生物标记物研究面临的问题和挑战

3.1 唾液样品的收集、处理和存储缺乏明确的标准 到目前为止，已经有文献报道超过100多种OSCC患者唾液中的生物标志物，但唾液样品的收集处理和储存没有标准化的流程，比如在采集前要求患者采用标准的饮食或使用标准的口腔清洁制剂。这使得这些生物标记物在不同的条件与实验状态下得出的研究结果的可信度让人怀疑，其重复性欠佳。比如有一些生物标记物由于样品的收集和处理方法不同，学者们得出了不同的结果。目前已经有学者在制备更可靠的标准化产品来迎合市场的需求，使未来通过唾液来诊断口腔癌症将得以实现。

3.2 唾液中生物标志物的可靠性 在不同的唾液生物标记物研究中，生物标记物的含量变化范围很大，缺乏一个合理的标准来进行规范。唾液中IL-6和IL-8是两种目前研究最多的生物标记物[19-21]，它们不仅仅是潜在口腔癌的检测物质，同时也作为监测慢性牙周炎和扁平苔癣等疾病活动的指数，其中扁平苔癣是一种影响着世界2%人群的慢性黏膜炎性疾病。在多种不同的研究中，健康人IL-6的变化范围就从(1.4±0.9)pg/ml到(47.46±18.74)pg/ml，而IL-8的范围从250 pg/ml]到(1945±181)pg/ml[22-24]。如果不同研究中IL-6和IL-8的浓度变化如此之大，人们就很难确定IL-6和IL-8的标准来说明OSCC的进展。

在上述研究中，相同的唾液组成成分在不同的研究中存在大幅度的变动，很大程度上是由于处理方法的不同，也有可能是由于物质本身的生物学变化。一些学者通过对OSCC患者唾液中潜在的特定蛋白质与健康成人中mRNA生物标记物的研究，已经对唾液的蛋白质组中物质内部与物质间的变化做出了相关报道。在临床试验研究中，生物样品自身的生物学变化严重阻碍了标准化的确定[25]。唾液中成分的变化受种族、地理位置、年龄、性别、饮食习惯、非肿瘤系统疾病、治疗药物等因素影响。例如，血浆内皮素1是OSCC患者唾液中潜在的生物标记物，然而患有充血性心衰或上消化道疾病如胃溃疡和胃炎等患者的唾液中血浆内皮素1的含量也明显增高[26]。目前还报道了唾液中某些蛋白的含量随年龄增长变化明显，但还未作为测定OSCC唾液中的潜在生物标记物。综上所述，这种物质内部和物质间的变化急需更多的相关研究来解释物质自身的生物学变化，从而为OSCC唾液中的生物标记物制定和完善提供合理的参考范围。

3.3 OSCC患者唾液中的生物标记物的进一步认证 在理想状态下，一个良好的临床检测方法应该具有较高的灵敏度和特异性。口腔内的环境常常受到各种因素的干扰，如炎症、外伤、牙菌斑、感染或者黏膜病损等。在各种复杂的条件影响下OSCC患者唾液中的生物标记物会受到何种影响目前未见到相关的报道[27]。大多数的研究并没有将这部分问题考虑在内，所以其结果不能排除这些因素的干扰，导致某些假阳性结果。这使得临床上通过唾液诊断OSCC尚难以实现。例如，IL-6、IL-8、IL-1β、碱性成纤维细胞生长因子、氧化应激分子等不仅是已知的OSCC患者唾液中的生物标记物，同时它们也参与炎症反应与创口愈合过程，并且在口腔扁平苔藓、牙周炎患者中其检测水平也与正常人不同。所以找到一种OSCC患者独特的生物标记物，增加其临床可靠性是临床迫切需要解决的问题。

4 展望

将唾液生物标记物应用于口腔癌症的早期诊断具有许多独特的优势，但是一些潜在的问题(如唾液的样本采集、处理和储存方法；其结果的可靠性；与其他慢性疾病或其他恶性肿瘤相区别的特异性标记物的确定；口腔内环境的改变导致其生物标记物变化等)还有待进一步的研究。如果想将该方法进入临床阶段，势必市场上需要出现标准化的处理方法及标准试剂。总之，唾液生物标记物对于口腔癌的早期诊断具有很大的潜力，将有可能成为未来对于口腔癌症诊断、检测疾病进展的新方法。

[1]郑家伟,李金忠,钟来平,等.口腔鳞状细胞癌临床流行病学研究现状[J].中国口腔颌面外科杂志,2007,5(2):83-90.

[2]Cheng Y,Wright J.Advances in diagnostic adjuncts for oral squamous cell carcinoma[J].The Open Pathology Journal,2011,5:3-7.

[3]Nikitakis NG,Sarlani E,Kolokythas A,et al.Frequency of pain and correlation with clinical and histologic parameters in t1 squamous cell carcinoma of the tongue:a retrospective pilot study[J].Journal of Oral&Facial Pain and Headache,2013,28(1):46-51.

[4]Castagnola M,Picciotti PM,Messana I,et al.Potential applications of human saliva as diagnostic fluid[J].Acta Otorhinolaryngol Ital, 2011,31(6):347-357.

[5]Chiappin S,Antonelli G,Gatti R,et al.Saliva specimen:a new laboratory tool for diagnostic and basic investigation[J].Clin Chim Acta,2007,383(1-2):30-40.

[6]Jou Y J,Hua CH,Lin CD,et al.S100A8 as potential salivary biomarker of oral squamous cell carcinoma using nanoLC-MS/MS[J]. Clinica ChimicaActa,2014,25(436):121-129.

[7]Messana I,Inzitari R,Fanali C,et al.Facts and artifacts in proteomics of body fluids.What proteomics of saliva is telling us?[J]. J Sep Sci,2008,31(11):1948-1963.

[8]Bălănescu,P,Lădaru A,Bălanescu E,et al.Systemic sclerosis biomarkers discovered using mass-spectrometry-based proteomics:a systematic review[J].Biomarkers,2014,19(5):345-355.

[9]Momen-Heravi F,Trachtenberg AJ,Kuo WP,et al.Genomewide study of salivary microRNAs for detection of oral cancer[J].Journal of Dental Research,2014,93(7 suppl):86S-93S

[10]Liao PH,Chang YC,Huang MF,et al.Mutation of p53 gene codon 63 in saliva as a molecular marker for oral squamous cell carcinoma [J].Oral Oncol,2000,36:272-276.

[11]Bahar G,Feinmesser R,Shpitzer T,et al.Salivary analysis in oral cancer patients:DNA and protein oxi-dation,reactive nitrogen species,and antioxidant profile[J].Cancer,2007,109:54-59.

[12]Sato J,Goto J,Murata T,et al.Changes in saliva interleukin-6 levels in patients with oral squamous cell carcinoma[J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod,2010,110:330-336.

[13]Zhong LP,Chen GF,Xu ZF,et al.Detection of telomerase activity saliva from oral squamous cell carcinoma patients[J].Int J Oral Maxillofac Surg,2005,34:566-570.

[14]Carvalho AL,Jeronimo C,Kim MM,et al.Evaluation of promoter hypermethylation detection in body fluids as a screening/diagnosis tool for head and neck squamous cell carcinoma[J].Clin Cancer Res,2008,14(1):97-107.

[15]Brinkmann O,Kastratovic DA,Dimitrijevic MV,et al.Oral squamous cell carcinoma detection by salivary biomarkers in a Serbian population[J].Oral Oncol,2011,47(1):51-55.

[16]Jou YJ,Lin CD,Lai CH,et al.Proteomic identification of salivary transferrin as a biomarker for early detection of oral cancer[J].Anal ChimActa,2010,681(1:2):41-48.

[17]Zhong L,Chen G,Xu Z,et al.Detection of telomerase activity in saliva from oral squamous cell carcinoma patients[J].Int J Oral and Maxillofac Surg,2005,34:366-370.

[18]Shpitzer T,Bahar G,Feinmesser R，et al.A comprehensive salivary analysis for oral cancer diagnosis[J].J Cancer Res Clin Oncol, 2007,133(9):613-617.

[19]杜 娟,颜雨春.口腔鳞状细胞癌患者唾液中CEA、IL-6、IL-8含量的检测[J].安徽医科大学学报,2010,45(4):579-581.

[20]Malpass GE,Arimilli S,Prasad GL,et al.Complete artificial saliva alters expression of proinflammatory cytokines in human dermal fibroblasts[J].Toxicological Sciences,2013,134(1):18-25.

[21]Dafar A,Rico P,Isik A,et al.Quantitative detection of epidermal growth factor and interleukin-8 in whole saliva of healthy individuals[J].Journal of Immunological Methods,2014,408:46-51.

[22]Rhodus NL,Ho V,Miller CS，et al.NF-kappaB dependent cytokine levels in saliva of patients with oral preneoplastic lesions and oral squamous cell carcinoma[J].Cancer Detect Prev,2005,29(1): 42-45.

[23]Leeman-Neill RJ,Seethala RR,Singh SV,et al.Inhibition of EGFR-STAT3 signaling with erlotinib prevents carcinogenesis in a chemically-induced mouse model of oral squamous cell carcinoma [J].Cancer Prevention Research,2011,4(2):230-237.

[24]Motamedi S,Shilagard T,Edward K,et al.Gold nanorods for intravital vascular imaging of preneoplastic oral mucosa[J].Biomedical optics express,2011,2(5):1194-1203.

[25]Fraser CG.Inherent biological variation and reference values[J]. Clin Chem Lab Med,2004,42(7):758-764.

[26]Denver R,Tzanidis A,Martin P,et al.Salivary endothelin concentrations in the assessment of chronic heart failure[J].Lancet,2000, 355(9202):468-469.

[27]Mankan AK,Lawless MW,Gray SG，et al.NF-kappaB regulation: the nuclear response[J].J Cell Mol Med,2009,13(4):631-643.

R739.8

A

1003—6350（2015）06—0857—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.06.0305

2014-09-02)

韩 冰。E-mail：569869924@qq.com