范晓光，李燕军

（天津科技大学生物工程学院，天津 300457）

基于分子生物学技术的胞苷生产菌的育种研究进展

范晓光，李燕军

（天津科技大学生物工程学院，天津 300457）

胞苷是一种重要的抗肿瘤、抗病毒药物的中间体。传统的胞苷生产菌的育种策略多采用物理或化学诱变的方法，结合代谢产物类似物的抗性筛选手段，得到能够有效积累胞苷的菌株。随着分子生物学的发展，利用基因敲除技术，通过阻断细胞的代谢旁路或引入突变位点，能够有效改变目的产物的产量或质量。对代表性的胞苷生产菌株枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的胞苷生物合成途径进行分析，并对其分子生物学育种策略进行了综述。

胞苷；分子生物学；合成途径；育种策略

胞苷（Cytidine）是一种嘧啶核苷，常作为中间体用于制造阿糖胞苷（Ara-C）、环胞苷（Cyclo C）、三磷酸胞苷（CTP）、胞二磷胆碱（CDP-Choline）等抗肿瘤、抗病毒药物。传统的制备胞苷的方法主要为RNA水解法或化学合成法[1]，但均存在着分离提纯繁琐，生产成本过高的问题。与上述方法相比，直接发酵法具有成本低廉，副产物少的特点，但由于代谢途径复杂，反馈阻遏和反馈抑制强烈，使得胞苷产量难于突破。因此，选育具有产量高、副产物少、发酵周期短、遗传性状稳定等特点的胞苷生产菌是直接发酵法生产胞苷的先决条件。

早期筛选胞苷生产菌株的方法多为诱变育种的方法。1989年，美国专利报道了具有胞苷脱氨酶缺失和嘧啶结构类似物抗性遗传标记的生产胞苷的枯草芽孢杆菌（IFO13719）和巨大芽孢杆菌（ATCC6251）突变株；1994年，日本专利报道了具有胞苷脱氨酶活力缺失、6-杂氮尿嘧啶抗性、抗500 μg/mL 5-氟胞苷抗性突变株B.subtilis No. 344，能够在发酵培养基中积累10.4 g/L胞苷；1995年，日本专利报道了3-脱杂氮尿嘧啶抗性突变株B.subtilis No.428，能够在发酵培养基中积累14.2 g/L；后来日本专利陆续报道了具有胞苷脱氨酶缺失、3-脱杂氮尿嘧啶抗性、5-氟胞苷抗性、氨甲酰磷酸合成酶活力增强以及高丝氨酸脱氢酶活力缺失等特性的突变株，其最大胞苷产率稳定在30 g/L左右。相比于国外，我国从2005年起才开始进行胞苷生产菌的选育及发酵优化研究。天津科技大学、华东理工大学等高校分别从发酵菌株和发酵条件等方面进行了一系列的探索工作，但胞苷的生产水平依旧较低，仅为5～6 g/L[2-3]。

近年来，随着分子生物学的发展，一系列新型的育种技术逐步运用到微生物菌体的改造之中。例如蛋白质（酶）分子定向进化育种技术，基因敲除育种技术以及全局转录机器工程技术等。随着越来越多菌株测序工作的完成或稳步推进，应用已有序列进行基因的功能性分析已越来越迫切与重要。因此，从胞苷生产菌株枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的代谢途径出发，通过利用传统诱变育种方法和现代分子生物学育种技术，构建和筛选出高产胞苷生产菌，这对提高我国胞苷生产水平具有十分重要的意义。

1 枯草芽孢杆菌的胞苷生物合成途径

图1 枯草芽孢杆菌嘧啶核苷生物合成及其代谢调控

枯草芽孢杆菌嘧啶核苷酸生物合成及代谢控制过程如图1所示：

枯草芽孢杆菌的嘧啶生物合成基因簇（pyrgene cluster），位于其染色体上，大小为12.5 kb，这段基因簇包含了的十段顺反子，多顺反子的转录顺序依次为pyrR、pyrP、pyrB、pyrC、pyrAA、pyrAB、pyrDII、pyrDI、pyrF、pyrE。其中pyrR编码pyr弱化调节蛋白，pyrP编码尿嘧啶通透酶，pyrB编码天冬氨酸转氨甲酰基酶，pyrC编码二氢乳清酸酶，pyrAA编码氨甲酰磷酸合成酶谷氨酰胺酶亚基，pyrAB编码氨甲酰磷酸合成酶催化亚基，pyrDII编码二氢乳清酸脱氢酶电子迁移亚基，pyr-DI编码二氢乳清酸脱氢酶催化亚基，pyrF编码乳清酸单磷酸脱羧酶，pyrE编码乳清酸磷酸核糖焦磷酸化酶。此外，pyr操纵子的三段非翻译区域在pyr的弱化调节中起着关键的作用[4-6]，这三段弱化区域分别位于5'端的前导序列（弱化区域1151 nt），pyrR和pyrP基因之间（弱化区域2173 nt），pyrP和pyrB基因之间（弱化区域3145 nt）。

2 枯草芽孢杆菌的育种策略

从枯草芽孢杆菌的生物合成途径中不难看出，其从头合成UMP是通过6个酶依次催化完成的。编码这些酶的pyr基因簇的表达受到过量的尿嘧啶阻遏，并表现出协同调节。另一方面，对这些酶的反馈抑制或反馈激活调节主要集中在第一个UMP合成酶，即天冬氨酸氨甲酰磷酸合成酶（CPSase）。总之，UMP生物合成酶的合成受到尿苷化合物的阻遏，同时可被胞嘧啶核苷酸和焦磷酸核糖（PRPP）激活，而CTP合成酶的合成受到胞苷化合物的阻遏，不受尿苷核苷酸的抑制。在诱变育种过程中要解除这些反馈抑制或阻遏，才能获得嘧啶核苷酸积累的菌种。苏静等[7]采用同源重组的方法敲除枯草芽孢杆菌TS8的胞苷脱氨酶基因cdd，阻断嘧啶代谢通量由胞苷流向尿苷和尿嘧啶。经实验验证，cdd基因缺失菌株的胞苷比原始菌株提高了44.19%且遗传性状稳定。方海田等[8]通过定点突变解淀粉芽孢杆菌中受UMP抑制的编码氨甲酰磷酸合成酶亚基的carB基因，获得了胞苷产量分别为野生菌株3.7倍和5.7倍的突变株。

3 大肠杆菌的胞苷生物合成途径

大肠杆菌嘧啶核苷酸生物合成及代谢控制过程如图2所示。大肠杆菌的操纵子主要由六个独立的操纵子carAB、pyrBI、pyrC、pyrD、pyrE和 pyrF组成，这六个操纵子分别编码UMP从头合成途径中涉及的六个酶，它们是不连序分散地位于染色体上。其中，carA编码氨甲酰磷酸合成酶的谷氨酰胺酶亚基，carB编码氨甲酰磷酸合成酶的催化亚基，pyrI编码天冬氨酸-转氨甲酰酶的调节亚基，pyrB编码天冬氨酸-转氨甲酰酶的催化亚基，pyrC编码二氢乳清酸酶，pyrD编码二氢乳清酸脱氢酶，pyrE编码乳清酸磷酸核糖基转移酶，pyrF编码5-磷酸乳清核苷脱羧酶，pyrH编码尿苷酸激酶，ndk编码二磷酸核苷激酶，pyrG编码胞苷三磷酸合成酶。

大肠杆菌操纵子的调节作用与枯草芽孢杆菌不同，比较复杂。其中，pyrBI、pyrE、pyrF操纵子的表达受尿苷酸的抑制，而pyrC和pyrD操纵子的表达主要受胞苷酸的抑制，carAB操纵子的表达对于嘧啶和精氨酸的生物合成是必须的，说明至少有两个抑制物控制着嘧啶操纵子的转录[9-11]。此外，在嘧啶限制的情况下，嘧啶操纵子的表达抑制作用是不一致的，说明每个操纵子表达的调节作用是个独立的机制[12]。经研究发现，大肠杆菌操纵子的调节作用一共有三种方式[13-16]：1）pyrBI和pyrE操纵子表达的弱化控制作用，通过此操纵子上的一个弱化区域控制操纵子的转录终止；2）pyrC和pyrD操纵子表达受CTP与转录位点的结合，可产生不同的转录作用；3）pyrBI操纵子的第二个控制机制是转录起始的反复转录反应，此反复转录机制还参与carAB、嘧啶补救途径操纵子codBA和upp-uraA的调节作用。

4 大肠杆菌的育种策略

与枯草芽孢杆菌不同，大肠杆菌中嘧啶核苷酸的生物合成只在三个控制点上受到终产物的反馈控制，催化这三步反应的酶都是变构酶。将天冬氨酸与氨甲酰磷酸转变为氨甲酰天冬氨酸的反应是此途径的关键步骤，催化该反应的天冬氨酸氨甲酰转移酶受到终产物CTP的反馈抑制，它被抑制将影响尿苷酸和胞苷酸的合成。另两个调节位点分别是由氨甲酰磷酸合成酶催化的反应，它受UMP的反馈抑制；由CTP合成酶催化的反应，受CTP的反馈抑制，它只影响胞苷酸的合成。

与枯草芽孢杆菌相比，大肠杆菌中受代谢产物抑制的酶较少且分散，因此目前对于大肠杆菌胞苷生产菌的分子生物学改造较多。苏静等[17]用过Red重组系统敲出了大肠杆菌MG3028基因组上的胞苷脱氨酶基因cdd，阻断了胞苷的分解代谢。然后，构建了含解淀粉芽孢杆菌TS8嘧啶操纵子结构基因的重组质粒pPYR3021，此操纵子编码UMP从头合成途径中的6个关键酶，然后将其转入E.coli MG3028（Δcdd）。与出发菌株相比，E.coli MG3028（Δcdd）的胞苷产量提高了近2倍，携带重组质粒的菌株的胞苷产量则提高了近6倍。吴晓娇等[18]通过过表达大肠杆菌中氨甲酰磷酸合酶和天冬氨酸氨甲酰磷酸转移酶的操纵子基因carAB和pyrBI，分别获得了比出发菌株胞苷产量高出85.3%和29.7%的基因工程菌株。方海田等[19]通过定点突变筛选到了抗反馈抑制的天冬氨酸氨甲酰转移酶ATCase，部分解除了胞苷三磷酸CTP对其的抑制，促进了胞苷的积累。

图2 大肠杆菌嘧啶核苷生物合成及其代谢调控

除了从头合成途径外，一些其他途径中的代谢产物的变化也会影响到胞苷的合成。方海田等[20-21]发现，在大肠杆菌中过表达编码磷酸核糖焦磷酸合成酶、6-磷酸果糖脱氢酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶（PPP途径中的三个关键酶）基因prs、zwf、gnd，胞苷产量与原始菌株相比提高了128%。在大肠杆菌中敲除胞苷脱氨酶基因cdd和高丝氨酸脱氢酶thrA（催化天冬氨酸到苏氨酸），同时导入解淀粉芽孢杆菌中与UMP合成相关的操纵子pyrA和pyrB，重组菌的胞苷产量比原始菌提高了3倍。

5 结语

微生物生产核苷是近代发酵工程领域的杰出成果，目前在国外已经实现了工业化生产。近年来我国在胞苷生产菌的选育方面取得了一些进展，但胞苷的整体发酵生产水平依然落后。因此只有从微生物的代谢途径出发，将传统的诱变育种与分子生物学育种结合起来，才能够更有效的提高胞苷产量，降低生产成本，获得经济效益。

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（责任编辑：朱小惠）

Research advance in cytidine production strain by molecular biology technology

FAN Xiaoguang,LI Yanjun
(College of Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China)

Cytidine is an important intermediate for antitumor or antiviral drugs.Traditional method for screening of cytidine producing strain was generally based on physical or chemical mutation combined with resistance screening method of metabolic product analogues to obtain high yield strain.With the development of molecular biology technology,the yield or quality of target product can be effectively improved by gene knockout technology to block cell metabolic pathways or introduce mutant site.In this study,the biosynthetic pathways of cytidine in B.subtilis and E.coli were analyzed,and the breeding strategy for cytidine production strain was reviewed.

cytidine;molecular biology;synthetic pathway;breeding strategy

Q933

A

1674-2214（2015）01-0053-05

2014-11-25

范晓光（1987—），男，天津人，讲师，博士，研究方向为氨基酸及有机酸的发酵过程控制，E-mail∶xiaoguangfan@tust.edu.cn.