陈 佳，杨诗颖，柯崇榕，黄建忠*

（福建师范大学生命科学学院，工业微生物发酵技术国家地方联合工程研究中心，福建 福州 350117）



乳酸乳球菌生产γ-氨基丁酸条件的优化

陈 佳，杨诗颖，柯崇榕，黄建忠*

（福建师范大学生命科学学院，工业微生物发酵技术国家地方联合工程研究中心，福建 福州 350117）

摘 要：采用析因设计和中心组合试验设计对乳酸乳球菌FJNU-GA1304产γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）的条件进行优化。完全析因设计优化后的细胞转化条件为：pH 3.5、反应温度40 ℃、反应时间24 h，谷氨酸钠质量浓度20 g/L和湿菌体质量浓度25 g/L；在单因素试验的基础上，通过筛选设计确定谷氨酸钠、玉米浆粉和葡萄糖质量浓度为主效因子。采用三因素三水平的中心组合试验对主效因子的交互作用进行分析，结果表明：最佳的培养基组成为谷氨酸钠9.50 g/L、玉米浆粉12.50 g/L、葡萄糖5.74 g/L、酵母膏5.00 g/L、K2HPO41.2 0 g/L、MgSO40.60 g/L。在最佳转化条件和发酵培养基组合下，GABA产量最高达9.06 g/L，比优化前4.80 g/L提高了88.8%。

关键词：γ-氨基丁酸；乳酸乳球菌；析因设计；筛选设计；中心组合试验设计

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是由L-谷氨酸或其衍生物在谷氨酸脱羧酶的作用下脱羧而成的一种非蛋白质组成的天然氨基酸，广泛存在于微生物、植物和动物细胞中[1-3]。GABA是哺乳动物中枢神经系统的抑制性传递物质，具有降血氨、抗焦虑、降血压、治疗糖尿病、改善肾机能和肝机能，促进乙醇代谢和消臭，以及高效减肥等生理功能，广泛应用于食品和医药行业中[4-9]。此外，GABA也作为饲料添加剂应用于畜牧业中[10-12]。

目前，GABA生产主要是通过微生物进行发酵[13]。乳酸菌是国际公认的食品安全级细菌，2009年12月国家卫生部已批准GABA用于食品生产加工，因此大部分研究集中于利用乳酸菌发酵生产GABA[14]。然而，乳酸菌属于兼性厌氧菌，生物量较低，直接以谷氨酸钠为底物进行发酵生产，底物残留较多，增加了下游提取纯化难度。林谦等[15]以10 g/L的谷氨酸钠为底物利用Lactobacillus fermentum YS2液体发酵生产GABA，产量仅为4.37 g/L；Ratanaburee等[16]以10 g/L的谷氨酸钠为底物利用Lactobacillus plantarum DW12液体发酵生产GABA，产量也只有4.00 g/L。同时，乳酸菌是以有机培养基进行发酵，发酵液中还有微生物菌体、代谢物、蛋白和色素等多种杂质，产品分离纯化步骤繁杂、设备要求高、成本高。针对此问题，张婷[17]探讨了两步法合成GABA。第一步是发酵收集菌体，第二步是全细胞催化GABA。相对于发酵液而言，反应液成分简单，不含大量有机成分，使产物分离纯化较简单。同时具有生产周期较短、转化率高及节约成本等优点。因此，本实验采用两步法生产GABA，探讨细胞转化条件对GABA产量和培养基组分对谷氨酸脱羧酶活性的影响，从而为规模化生产GABA提供一定的理论基础。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）FJNU-GA1304，由工业微生物发酵技术国家地方联合工程研究中心（福建师范大学）保藏。

γ-氨基丁酸标准品（纯度≥99%）美国Sigma公司；异硫氰酸苯酯美国Aladdin公司；乙腈（色谱纯） 美国Sinence公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2仪器与设备

U-3000高效液相色谱系统（配有DAD检测器）美国Thermo Scientific公司。

1.3培养基

种子培养基（g/L）：牛肉膏10、酵母膏5、葡萄糖20、蛋白胨10、K2HPO42、无水乙酸钠 5、柠檬酸三铵2、MgSO4·7H2O 0.58、MnSO4·4H2O 0.25，吐温-80 1 mL，pH 6.8。

初始发酵培养基（g/L）：酵母膏10、葡萄糖10、K2HPO41、MgSO4·7H2O 1、谷氨酸钠5，pH 7.0。

1.4液体培养条件

按体积分数5%的初始接种量将种子液接入发酵培养基中，装液量为35 mL/150 mL，温度为30 ℃，静置培养12 h。

1.5GABA产量的测定

发酵液离心，收集菌体，称取湿菌体质量，计算对应的生物量。采用含有10 g/L谷氨酸钠的醋酸-醋酸钠缓冲溶液重悬菌体，使最终转化液中湿菌体质量浓度为4 g/100 mL，在一定条件下反应后，以沸水浴10 min结束反应，10 000×g离心5 min，取上清液测定GABA的质量浓度，是以异硫氰酸苯酯（phenylisothiocyanate，PITC）作为衍生剂通过高效液相色谱进行测定[18]。

色谱条件：Hypersil GOLD C18色谱柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm），检测波长254 nm，流动相：V（醋酸钠缓冲液）∶V（乙腈）=4∶1，柱温40 ℃，流速0.8 mL/min，进样量5 μL。

1.6细胞转化条件的优化

使用N=20完全析因试验对影响细胞转化的pH值、反应温度、反应时间、谷氨酸钠和湿菌体的质量浓度5 个因素进行优化，见表1。

表1　细胞转化条件因素Table 1 Level and code of conversion conditions used for full factorial design

1.7培养基组分的优化

1.7.1 单因素试验和筛选设计

以初始发酵培养基为基础，分别以10 g/L的可溶性淀粉、蔗糖、丁二酸钠、葡萄糖、乳糖和果糖作为单一碳源，确定最佳碳源；再分别以10 g/L的硝酸钠、硫酸铵、玉米浆粉、酵母膏、蛋白胨、牛肉膏和胰蛋白胨作为单一氮源，确定最佳氮源。根据最适碳氮源修改初始发酵培养基组分，采用JMP中的N=16的筛选设计分析培养基组分中影响GABA产量的主效因素。

1.7.2 中心组合试验设计

通过最陡爬坡试验确定3 个主效因素的中心点，利用SAS 9.2软件根据响应面曲面设计原理，采用三因素三水平的中心组合试验设计，确定主效因素的最佳水平。

2　结果与分析

2.1细胞转化条件优化

图1　细胞转化条件优化实验结果Fig.1 Results of optimal conversion conditions

细胞转化生产GABA实际上是利用细胞内的谷氨酸脱羧酶（glutamate decarboxylase，GAD）将运输通过细胞壁进入胞内的谷氨酸进行脱羧形成。如图1所示，通过标准最小二乘法构建模型的线性拟合表明，pH值是最主要的影响因素，当pH值为5.5时，GABA产量均低于0.124 g/L；其次是谷氨酸钠，在pH 3.5的基础上，当谷氨酸钠的质量浓度为20 g/L时，GABA产量均大于3 g/L；且当pH 3.5时，底物质量浓度20 g/L时，反应温度为40 ℃更有利于提高GABA的产量。这是因为任何酶都需要在合适的pH值和温度条件下才能体现出其最大的活性，而且在酸性条件下细菌需要通过将胞外的谷氨酸运入胞内脱羧生成氨基丁酸并消耗一质子来维持自身pH值[19]。因此，较低的pH值和高质量浓度的谷氨酸钠有利于GABA的生成。此外，较高的温度能够提高细胞壁的通透性，有利于谷氨酸进入细胞内。因而最终确定pH 3.5、反应温度40 ℃、反应时间24 h、谷氨酸钠质量浓度20 g/L和湿菌体质量浓度25 g/L作为细胞转化GABA的条件。

2.2碳氮源的选择

图2　不同碳源对GABA产量的影响Fig.2 Effect of carbon sources on GABA production

图3　不同氮源对GABA产量的影响Fig.3 Effect of nitrogen sources on GABA production

细胞内单位细胞的转化效率受培养基组分的影响，因此需要对培养基组分进行优化。首先探讨最适的碳氮源，如图2所示，以乳糖为碳源最有利于提高单位细胞转化效率，GABA产量最高达到5.93 g/L；其次为葡萄糖5.33 g/L。通过方差分析和多重比较表明，不同碳源对GABA的产量以及生物量的影响差异显著。考虑到葡萄糖有利于菌体生长且价格低廉，故选定葡萄糖作为碳源。

以葡萄糖为碳源，分析不同氮源对GABA产量的影响。如图3所示，以玉米浆粉、胰蛋白胨或酵母膏作为氮源时，GABA产量较高，分别为6.98、6.02 g/L和5.23 g/L。黄桂东等[20]发现采用复合氮源有利于菌体内单位细胞转化效率的提高，从而提高GABA的产量。由于胰蛋白胨价格高昂，因此选取玉米浆粉和酵母膏作为复合氮源。考虑到玉米浆粉最有利于提高GABA产量，故确定玉米浆粉和酵母膏的质量浓度分别为7 g/L和3 g/L。

2.3筛选设计

培养基组分较多，需先对各个组分进行拟合分析，筛选出主效组分。在单因素试验的基础上，采用N=16的筛选设计，结果如表2所示。

表2　主效组分的筛选设计与结果Table 2 Screening design of medium components and results

利用JMP 11.0进行数据处理和因素效应分析，结果表明，谷氨酸钠和玉米浆粉质量浓度对GABA产量影响最大（P＜0.01），其次为葡萄糖和酵母膏质量浓度（P＜0.05）。这是由于GABA是由谷氨酸脱羧酶（GAD）脱羧形成的，而GAD是诱导酶，需要一定质量浓度的谷氨酸钠作为诱导物。此外，回归分析表明葡萄糖和MgSO4为负效应因素，适当减少其质量浓度有利于提高GABA产量。

2.4最陡爬坡试验设计

根据筛选设计结果，确定谷氨酸钠、玉米浆粉和葡萄糖为主效因子进行最陡爬坡试验，逼近GABA的最大产量区，而酵母膏、K2HPO4和MgSO4的质量浓度分别设为5、1.2 g/L和0.6 g/L。由表3可知，第5组试验的GABA产量最高，达到8.61 g/L。因此，选择葡萄糖、玉米浆粉和谷氨酸钠质量浓度分别为6、11.2 g/L和11 g/L时作为中心组合试验设计的中心点。

表3　最陡爬坡试验设计及结果Table 3 Steepest aasscent design with experimental values of GABA yield

2.5中心组合试验设计

2.5.1 中心组合试验结果与分析

葡萄糖、玉米浆粉和谷氨酸钠的质量浓度响应面试验方案及结果见表4。16 组试验点中有14 个析因点，2 个用以估算试验误差的零点。利用SAS 9.2软件对数据进行回归分析，发现GABA响应值均在95%的置信区间内，且残差在±5 RSD之间，正态分布呈一直线，表明该试验结果可信、没有噪音数据。

2.5.2 中心组合试验显著性检验

方差分析（表5）表明，不同组分间的差异显著，表明试验方法准确可靠，通过拟合回归构建二阶响应模型是可行的，回归模型P值小于0.01且相关系数R2=96.40%（＞90%），表明该模型极显著且拟合良好，可用于分析预测不同组分的质量浓度配比对GABA产量的影响。

表5　二次回归模型的方差分析结果Table 5 Analysis of variance for the fitted quadratic regression model

由表5中的P值可知，葡萄糖、玉米浆粉及其与谷氨酸钠的交互作用对GABA产量有极显著影响（P＜0.01）；谷氨酸钠和葡萄糖二次项对GABA产量有显著影响（P＜0.05），表明不同质量浓度的葡萄糖、玉米浆粉和谷氨酸钠对GABA产量的影响呈曲面关系，交互项作用显著，二次项影响较小。根据模型预测分析，当葡萄糖为5.74 g/L、玉米浆粉为12.5 g/L和谷氨酸钠为9.50 g/L时，GABA最高产量可达9.47 g/L。

2.6验证实验

根据中心组合试验确定的最优培养基配方进行摇瓶发酵验证，以优化前的条件做对照，实验重复3 次。3 次实验优化后的GABA平均产量为9.06 g/L，与预测产量9.47 g/L相差不到5%，说明模型较好地拟合了不同组分配比对GABA产量的影响。

3　结 论

本研究对一株具有产GABA能力的乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）FJNU-GA1304进行了细胞转化条件和培养基组分的优化。通过完全析因设计对细胞转化条件优化，确定了有利于提高GABA产量的细胞转化条件是pH 3.5、反应温度40 ℃、反应时间24 h、谷氨酸钠质量浓度20 g/L和湿菌体质量浓度25 g/L。GABA的产量直接受谷氨酸脱羧酶影响[21]。要提高GABA的产量，首先应获得较高产量的GAD，提高单位细胞转化率，即培养基组分必须有利于细胞的增殖，同时菌体还应具有较高的GAD活性。因此，在优化后的细胞转化条件的基础上，通过单因素试验结合中心组合试验，对发酵培养基组分进行优化，以期提高单位质量菌体内的GAD产量，最终提高GABA的产量。优化后得到有利于提高GABA生成量的发酵培养基组分为谷氨酸钠9.50 g/L、玉米浆粉12.50 g/L、葡萄糖5.74 g/L、酵母膏5.00 g/L、K2HPO41.20 g/L、MgSO40.60 g/L。在最佳转化条件和发酵培养基组合下，转化液中GABA产量为9.06 g/L，比优化前4.80 g/L提高了88.8%。

参考文献：

[1]LIN Qian. Submerged fermentation of Lactobacillus rhamnosus YS9 for gamma-aminobutyric acid (GABA) production[J]. Brazilian Journal of Microbiology, 2013, 44(1): 183-187.

[2]MATSUYAMA A, YOSHIMURA K, SHIMIZU C, et al. Characterization of glutamate decarboxylase mediating γ-amino butyric acid increase in the early germination stage of soybean[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2009, 107(5): 538-543.

[3]RICHARDSON G, DING H, ROCHELEAU T, et al. An examination of aspartate decarboxylase and glutamate decarboxylase activity in mosquitoes[J]. Molecular Biology Reports, 2010, 37(7): 3199-3205.

[4]WAAGEPETERSEN H S, SONNEWALD U, SCHOUSBOE A. The GABA paradox: multiple roles as metabolite, neurotransmitter, andneurodifferentiative agent[J]. Journal of Neurochemistry, 1999, 73(4): 1335-1342.

[5]江波. GABA(γ-氨基丁酸): 一种新型的功能食品因子[J]. 中国食品学报, 2008, 8(2): 1-4.

[6]DEFEUDIS F. γ-Aminobutyric acid and cardiovascular function[J]. Experientia, 1983, 39(8): 845-849.

[7]HAYAKAWA K, KIMURA M, K ASAHA K, et al. Effect of γ-aminobutyric acid-enriched dairy product on the blood pressure of spontaneously hypertensive and normotensive Wistar-Kyoto rats[J]. British Journal of Nutrition, 2004, 92(3): 411-417.

[8]COHEN I, NAVARRO V, CLEMENCEAU S, et al. On the origin of interictal activity in human temporal lobe epilepsy in vitro[J]. Science, 2002, 298: 1418-1421.

[9]KRNJEVIĆ K. Chemical nature of synaptic transmission in vertebrates[J]. Physiological Reviews, 1974, 54(2): 418-540.

[10]ZHANG Min, ZOU Xiaoting, LI Hui, et al. Effect of dietary γ-aminobutyric acid on laying pe rformance, egg quality, immune activity and endocrine hormone in heat-stressed Roman hens[J]. Animal Science Journal, 2012, 83(2): 141-147.

[11]郑艺梅, 刘丽妹, 符稳群. 家禽生产中γ-氨基丁酸的应用[J]. 粮食与饲料工业, 2014(1): 46-49.

[12]杨胜远, 陆兆新, 吕风霞, 等. γ-氨基丁酸的生理功能和研 究开发进展[J]. 食品科学, 2005, 26(9): 546-551.

[13]LI Haixing, CAO Yusheng. Lactic acid bacterial cell factories for gamma-aminobutyric acid[J]. Amino Acids, 2010, 39(5): 1107-1116.

[14]食品与发酵工业编辑部. 卫生部批准γ-氨基丁酸等6种新资源食品用于食品生产加工[J]. 食品与发酵工业, 2010, 36(2): 144.

[15]林谦, 姜康怡, 韦素娟, 等. 产GABA发酵乳 杆菌的筛选、发酵条件优化及其谷氨酸脱羧酶基因的克隆[J]. 广东农业科学, 2014(8): 192-197.

[16]RATANABUREE A, KANTACHOTE D, CHARERNJIRATRAKUL W, et al. Enhancement of γ-aminobutyric acid in a fermented red seaweed beverage by starter culture Lactobacillus plantarum DW12[J]. Electronic Journal of Biotechnology, 2011, 14(3): 1-14.

[17]张婷. HPLC法测定转化液中γ-氨基丁酸含量及转化液 的预处理研究[D]. 郑州: 郑州大学, 2012.

[18]许建军, 江波, 许时婴. 比色法快速测定乳酸菌谷氨酸脱羧酶活力及其应用[J]. 微生物学通报, 2004(2): 66-71.

[19]KAN JEE U, HOURY W A. Mechanisms of acid resistance in Escherichia coli[J]. Annual Review of Microbiology, 2013, 67: 65-81.

[20]黄桂东, 毛健, 姬中 伟, 等. 一株产γ-氨基丁酸植物乳杆菌mj0301培养基的优化[J]. 食品科学, 2013, 34(17): 165-170. doi: 10.7506/spkx1002-6630-201317036.

[21]FAN Euyu, HUANG Jun, HU Sheng, et al. Cloning, sequencing and expression of a glutamate decarboxylase gene from the GABA-producing strain CG MCC 1306[J]. Annals of Microbiology, 2012, 62(2): 689-698.

Optimization of Conditions for the Production of γ-Aminobutyric Acid by Lactococcus lactis

CHEN Jia, YANG Shiying, KE Chongrong, HUANG Jianzhong*

(National-Local United Engineering Research Centre of Industrial Microorganism Fermentation Technology, College of Life Science Fujian Normal University, Fuzhou 350117, China)

,

Abstract:Factorial design and central composite design were applied to optimize the yield of γ-aminobutyric acid (GABA) produced by cultured Lactococcus lactis cells from monosodium glutamate in a buffer solution. A full factorial design was used to optimize the conversion conditions as 40 ℃, pH 3.5 and 24 h. Using single factor designs, sodium glutamate, corn steep powder and glucose concentration were identified as major factors affecting GABA production. The interaction effect of the major factors at three levels each was analyzed by central composite design. The results showed that the optimal medium for Lactococcus lactis consisted of 9.5 g/L sodium glutamate, 5.74 g/L glucose, 12.50 g/L corn steep powder, 5.00 g/L yeast extract, 1.20 g/L K2HPO4and 0.60 g/L MgSO4. Under these conditions, the yield of GABA was 9.06 g/L, which was increased by 88.8% when compared with that (4.80 g/L) before optimization.

Key words:γ-aminobutyric acid; Lactococcus lactis; factorial design; screening design; central composite design

doi:10.7506/spkx1002-6630-201507027

中图分类号：TQ922

文献标志码：A

文章编号：1002-6630（2015）07-0148-05

*通信作者：黄建忠（1966—），男，教授，博士，研究方向为微生物功能基因。E-mail：hjz@fjnu.edu.cn

作者简介：陈佳（1990—），女，硕士研究生，研究方向为食品微生物。E-mail：happierjia@163.com

基金项目：福建省自然科学基金重点项目（2012N0013）

收稿日期：2014-05-04