·综述·

Lgr5与卵巢癌关系的研究进展

李娅茹(综述)，冯玉珍(审校)(河北医科大学第三医院妇产科，河北 石家庄 050051)

[关键词]卵巢肿瘤；受体，G-蛋白偶联；综述文献

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.12.036

卵巢癌是妇科三大恶性肿瘤之一，发病率仅次于宫颈癌和子宫体癌列居第3位，但致死率却居首位。由于其位于盆腔深部，早期无明显临床表现，而且缺乏有效的诊断依据，所以约80%患者到晚期才能确诊。早期卵巢癌患者经有效治疗5年生存率超过90%，而晚期卵巢癌患者由于化疗耐受和复发，5年生存率仅在30%左右，严重危害女性的生命和健康，其发病机制尚不清楚。肿瘤干细胞假说是新近发展起来的理论，认为肿瘤干细胞是肿瘤组织中具有自我更新及多分化潜能的干细胞样细胞，可能源于正常干/祖细胞的恶性转化，虽然占肿瘤组织的极少数，却是肿瘤发生发展、转移、耐药和复发的根源。目前研究学者从生物学特性和功能等方面验证了肿瘤干细胞的存在。富含亮氨酸重复序列G蛋白偶联受体5(leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptor 5,Lgr5)是Wnt/β-catenin信号通路的靶基因，在多种肿瘤中过表达，为潜在的肿瘤干细胞标记物。卵巢和输卵管中Lgr5阳性干细胞可能是卵巢癌起源的关键细胞，在卵巢癌中广泛表达，与卵巢癌的发生发展密切相关。现就Lgr5与卵巢癌关系的研究进展综述如下。

1Lgr5的生物学特性

Lgr5是参与信号传导的细胞表面分子，是新发现的G蛋白偶联受体家族视紫红质亚家族的成员，该亚家族中Lgr4、Lgr5和Lgr6的关系密切，它们的胞外区含13～18个富含亮氨酸的重复序列，Lgr4、Lgr5、Lgr6基因首先从卵泡刺激素、黄体生成素和促甲状腺激素等糖蛋白激素受体家族的同源物中被筛选出来。人类Lgr5基因长约144 kb，位于染色体12q22～23[1]，其编码的Lgr5蛋白的外功能区含17个富含亮氨酸重复序列，7次α螺旋跨膜区高度保守。Lgr5在大脑、眼睛、毛囊、乳腺、胃肠道及生殖器官等多种正常组织中表达，最初因未发现其生理性配体而被称为孤儿受体，最近才发现R-脊椎蛋白(R-spondins，RSPOs)是其内源性配体，与Lgr5、卷曲脂蛋白受体相关蛋白5和6结合形成蛋白质复合物，可增强Wnt/β-catenin通路信号，在干细胞自我更新等过程中起重要作用[2]。

2Lgr5与卵巢干细胞

卵巢表面上皮(ovarian surface epithelium，OSE)因周期性排卵而发生破裂和重塑，但对其维持动态平衡的机制知之甚少。研究发现干细胞可以驱动多种组织上皮的动态平衡[3-4]，但尚未在卵巢中被证实。研究发现，排列在排卵卵泡和输卵管伞边缘上皮的一些细胞，表现出干细胞特性[5-6]。然而，对于这些上皮细胞亚群的干细胞功能没有正式的论证。Lgr5已被证实为胃、肾脏和乳腺等组织的干细胞标记物[5-6]。

Ng等[7]研究发现，Lgr5最早出现在胚胎第13.5天，在卵巢器官形成中广泛表达，出生后表达逐渐限制在OSE，成年后表达主要限制在OSE增殖区和卵巢系膜-输卵管伞交界上皮；重要的是，在非排卵区分裂细胞中Lgr5阳性细胞比例很低，而在排卵区Lgr5阳性细胞比例明显增高(约50%)，推测Lgr5阳性细胞可能参与了排卵后组织修复。随后长期追踪LacZ转基因小鼠，随访标记LacZ的Lgr5阳性细胞的后代，结果显示胚胎和新生鼠仔LacZ阳性克隆扩增并最终促成了OSE细胞谱系、卵巢系膜韧带和输卵管上皮；此外，报告基因活性在成体组织中长期维持，最大克隆总是位于排卵卵泡周围或修复的上皮区域，表明成体Lgr5阳性细胞群维持OSE平衡和排卵后再生修复；还发现Lgr5阳性细胞具有自我更新和生成不同表型细胞类型的能力，认为Lgr5可作为卵巢和输卵管上皮干/祖细胞的标记物。然而，Flesken-Nikitin等[8]研究发现，这些Lgr5阳性干细胞定位于卵巢门(即OSE、间皮和输卵管上皮的交界处)，在排卵后增殖增强，并通过自我更新修复排卵后受损的卵巢部位；随后将敲除了抑癌基因Trp53和Rb1的卵巢门干细胞注入到8只小鼠腹腔，其中7只发展为高级别浆液性癌，并有5只发生肺转移，可能是卵巢癌的起源。这些研究结果也许还与临床相关，因为OSE和输卵管上皮被认为是卵巢癌的起源，而卵巢门为组织的交界性区域，因此卵巢和输卵管中Lgr5阳性干细胞可能是卵巢癌的起源细胞。

3Lgr5在卵巢癌中的表达、定位

Lgr5在结肠、直肠、胃和皮肤等[9-11]多种肿瘤中均过表达。

翟颖仙等[12]通过免疫组织化学分析了33例卵巢浆液性乳头状腺癌、6例卵巢浆液性囊腺瘤和6例正常卵巢组织中Lgr5的表达，发现Lgr5主要表达在细胞质；Lgr5在正常卵巢的上皮、卵泡细胞、血管壁、间质以及肿瘤细胞中均有表达，但它在卵巢囊腺瘤组织中的表达阳性率与正常卵巢组织比较差异无统计学意义，而在囊腺癌组织中的表达却显著高于以上卵巢囊腺瘤组织和正常卵巢组织；此外，卵巢囊腺癌组织中Lgr5的表达率从高分化到低分化也逐渐升高。Amsterdam等[13]通过免疫组织化学法分析了11例绝经后妇女正常卵巢组织、12例交界性卵巢肿瘤组织和12例卵巢浆液性癌组织(Ⅱ期)中Lgr5的表达，结果显示在正常卵巢组织中Lgr5主要定位于上皮细胞胞浆，在交界性肿瘤和卵巢浆液性癌中Lgr5主要定位于肿瘤细胞胞浆。费梦等[14]通过甲基化特异性聚合酶链式反应法分析了各种卵巢组织中Lgr5启动子DNA甲基化情况，发现Lgr5甲基化与上皮性卵巢癌的分化程度、肿瘤分期Ⅲ～Ⅳ及淋巴结转移密切相关，也可作为判断上皮性卵巢癌患者总预后的指标之一。以上的研究均表明，Lgr5的表达与卵巢癌发生发展密切相关。

4卵巢癌干细胞的分离和鉴定

研究卵巢癌的肿瘤干细胞，首先要对其进行分离和鉴定。由于肿瘤干细胞数量极少，缺乏明确的形态学特征，目前主要依赖其功能学特性或表面标记进行分离。主要有以下3种方法[15]：①无血清悬浮培养法，卵巢癌组织或腹腔积液中的肿瘤细胞在无血清培养基中形成肿瘤细胞球，异体移植后可形成肿瘤；②SP细胞分选法，SP细胞可将细胞内Hoechst33342等荧光染料泵出细胞而在显微镜下不着色或浅着色，结合荧光活化细胞分选技术(fluorescence activated cell sorter，FACS)可将SP细胞分离出来，并随后证实其具备自我更新、多分化潜能及表达干细胞相关基因等肿瘤干细胞特性；③表型标记筛选法，肿瘤干细胞假说认为肿瘤干细胞源于正常干细胞的突变，因此与正常干细胞有相似的细胞表面标记，通过抗原-抗体反应的免疫分选技术[如FACS、磁性细胞分选技术(magnetic actived cell soring,MACS)]实现肿瘤干细胞的分离。以上3种方法均有一定的局限性：无血清悬浮培养法和SP细胞分选法不能直接分离Lgr5阳性卵巢癌干细胞，只能富集包含Lgr5阳性细胞在内的肿瘤干细胞。应用肿瘤干细胞的表型标记筛选既简单又直观，而卵巢癌的病理类型多、异质性强，且对正常卵巢组织干细胞的研究较少，故寻找卵巢癌干细胞的特异标记更加困难。近年来，卵巢癌干细胞标记的研究主要借鉴于其他实体肿瘤，研究较广泛的有CD133、CD117、CD44、ALDH1、ABCG2、Lgr5等。Lgr5是一个7次跨膜G蛋白偶联受体，由于现有抗体对Lgr5抗原表位的识别不同，导致其在细胞的定位不同。要通过FACS和MACS分离Lgr5阳性卵巢癌干细胞，需要该抗体能识别Lgr5的胞外部分。

由于无法从形态学上来辨别卵巢癌干细胞，因此只能根据其致瘤性、化疗耐药性等干细胞特性进行鉴定。目前鉴别肿瘤干细胞的“金标准”为体外增殖实验和异种移植成瘤实验。尽管此方法筛选出的“干细胞样细胞”具备肿瘤干细胞的特性，但体外实验始终无法模拟人体内复杂的肿瘤微环境和转移特性；甚至有研究发现，很多不具备干细胞特性的细胞在异种移植后也具有致瘤性[16]。因此，该方法用于鉴定卵巢癌干细胞有一定的局限性，还需要进一步改进实验的条件和方法，分析体内外的差异，寻找特异性标记物，这有助于全面认识卵巢癌干细胞的特性。

5小结与展望

综上所述，卵巢癌是一种异质性强的肿瘤，卵巢癌干细胞可能参与卵巢癌的发生和发展。虽然致力于分离、鉴定卵巢癌干细胞的研究很多，但对于卵巢癌组织中Lgr5的研究还比较少，Lgr5在卵巢肿瘤中表达，Lgr5阳性肿瘤细胞是否代表了肿瘤干细胞，还需要通过细胞分离和异种移植方法来证实，但这些方法还需要改进。当前很多药物为G蛋白偶联受体激动剂或拮抗剂，因此Lgr5有可能成为卵巢癌治疗的靶点。如果我们能够明白控制Lgr5阳性细胞增殖的信号，干预治疗可能将改变卵巢癌可怕的预后。

[参考文献]

[1]Nakata S,Phillips E,Goidts V.Emerging role for leucine-rich repeat-containing G-protein-coupled receptors LGR5 and LGR4 in cancer stem cells[J].Cancer Manag Res,2014,6:171-180.

[2]de Lau W,Barker N,Low TY,et al.Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling[J].Nature,2011,476(7360):293-297.

[3]Barker N,Rookmaaker MB,Kujala P,et al.Lgr5(+ve) stem/progenitor cells contribute to nephron formation during kidney development[J].Cell Rep,2012,2(3):540-552.

[4]Plaks V,Brenot A,Lawson DA,et al.LGR5-expressing cells are sufficient and necessary for postnatal mammary gland organogenesis[J].Cell Rep,2013,3(1):70-78.

[5]Paik DY,Janzen DM,Schafenacker AM,et al.Stem-like epithelial cells are concentrated in the distal end of the fallopian tube:a site for injury and serous cancer initiation[J].Stem Cells,2012,30(11):2487-2497.

[6]Gamwell LF,Collins O,Vanderhyden BC.The mouse ovarian surface epithelium contains a population of LY6A(SCA-1) expressing progenitor cells that are regulated by ovulation-associated factors[J].Biol Reprod,2012,87(4):80.

[7]Ng A,Tan S,Singh G,et al.Lgr5 marks stem/progenitor cells in ovary and tubal epithelia[J].Nat Cell Biol,2014,16(8):745-757.

[8]Flesken-Nikitin A,Hwang CI,Cheng CY,et al.Ovarian surface epithelium at the junction area contains a cancer-prone stem cell niche[J].Nature,2013,495(7440):241-245.

[9]He S,Zhou H,Zhu X,et al.Expression of Lgr5,a marker of intestinal stem cells,in colorectal cancer and its clinicopathological significance[J].Biomed Pharmacother,2014,68(5):507-513.

[10]Xi HQ,Cui JX,Shen WS,et al.Increased expression of Lgr5 is associated with chemothera py resistance in human gastric cancer[J].Oncol Rep,2014,32(1):181-188.

[11]Liu S,Gong Z,Chen M,et al.Lgr5-positive cells are cancer stem cells in skin squamous cell carcinoma[J].Tumour Biol,2014,35(11):11605-11612.

[12]翟颖仙,张丽红,周莉,等.肿瘤干细胞标记物LGR5和CD133在卵巢癌中的表达和意义[J].中国实验诊断学,2013,17(9):1598-1601.

[13]Amsterdam A,Raanan C,Schreiber L,et al.Localization of the stem cell markers LGR5 and Nanog in the normal and the cancerous human ovary and their inter-relationship[J].Acta Histochem,2013,115(4):330-338.

[14]费梦,张传宏.lgr5启动子甲基化在上皮性卵巢癌中的表达及临床意义[J].长江大学学报：自然科学版，2012,9(10):6-8.

[15]杨柳,乔杰,郭红燕.卵巢癌肿瘤干细胞分离鉴定方法的进展[J].现代妇产科进展,2013,22(9):759-761.

[16]Nguyen LV,Vanner R,Dirks P,et al.Cancer stem cells:an evolving concept[J].Nature Reviews Cancer,2012,12(2):133-143.

(本文编辑：赵丽洁)

[中图分类号]R737.31

[文献标志码]A

[文章编号]1007-3205(2015)12-1486-03

[作者简介]李娅茹(1988-)，女，河北衡水人，河北医科大学第三医院医学硕士研究生，从事妇产科疾病诊治研究。

[收稿日期]2015-03-09；[修回日期]2015-04-19