一个常染色体显性遗传性先天性白内障家系分析①

2015-03-16王海峰王遵敬

黑龙江医药科学 2015年3期

王海峰，张娜，王遵敬

(1.林口县人民医院眼科,黑龙江林口 157600；2.哈尔滨医科大学附属第二医院眼科，黑龙江哈尔滨 150007；3、牡丹江市第二人民医院眼科，黑龙江牡丹江 157000)

目的：对1个常染色体显性遗传性先天性白内障家系进行基因突变热点的筛查，以探索其潜在的遗传学缺陷。方法：经过详细的病史采集及完善的眼科学检查后，对1个家系共10名成员(包括患者，非患者)抽取外周血提取基因组DNA，针对国内外文献报道的与常染色体显性遗传先天性白内障发病相关的10个基因设计引物，PCR扩增后直接测序进行候选基因的突变检测。结果：被检查者的10个发病相关基因序列中，CRYBA4基因第四个外显子上c.281T>C突变，并由此导致了βA4晶状体蛋白第94位的苯丙氨酸被丝氨酸取代，其余9个与GenBank发表的正常序列相同。结论：CRYBA4基因外显子上发现的已经报道过的杂合型突变位点，可能是这个家系的致病基因，其对先天性白内障的作用需进一步研究。

先天性白内障；常染色体显性遗传；基因突变；序列分析

先天性白内障是由于晶状体在胚胎发育过程中代谢异常而导致透明度下降的疾病，是一种严重的致盲性晶状体疾病。遗传性先天性白内障可以只表现为晶状体的单一混浊，也可伴发眼部及其他系统的先天性异常。其遗传方式有三种，既常染色体显性、常染色体隐性及X连锁隐性遗传，其中以常染色体显性先天性白内障最为常见。研究显示任何参与、影响晶状体发育的基因突变都可能导致先天性白内障的发生。目前约有60个致病位点被证明与先天性白内障有关，有20多个基因检测到了与先天性白内障相关的突变，突变导致晶状体结构和代谢的异常，从而诱发白内障的发生。这些基因包括晶状体蛋白基因(主要包括α-晶体蛋白，β-晶体蛋白和γ-晶体蛋白，此外还有含量很少的ζ和μ晶状体蛋白)、膜蛋白基因(主要包括缝隙连接通道蛋白GJA3和GJA8和主要内源性蛋白MIP)、细胞骨架蛋白基因、转录调节因子基因(包括HSF4，MAF，PAX6 等)等。目前白内障的发病机制尚未清楚，对其致病基因进行筛查是探索先天性白内障发病内在机制的重要手段。

1 资料与方法

1.1 一般资料

研究对象为在哈尔滨医科大学附属第二临床医学院眼科确诊的一个3代常染色体显性遗传先天性白内障家系，共有成员10名，其中先天性白内障患者3名，非白内障患者5名，未确诊患者2名。除了未确诊患者其余所有的入选人员均在哈尔滨医科大学附属第二临床医学院接受全身及眼部检查。

1.2 方法

对5名家系成员(患者3名，非患者2名)常规抽取外周血5ml,EDTA抗凝，用北京天根生物科技公司的血液基因组提取试剂盒提取基因组DNA，稀释至工作浓度后置于-20°C保存备用。

根据Genbank中的10个基因的序列，应用PRIMER6.0设计引物，通过上海生工生物公司合成，以基因组DNA为模板，通过PCR反应对目的片段进行扩增。使用Chromas查看测序峰图，用LasergeneSeqMan及BLAST在线网站将扩增片段的测序结果与在线的数据库中正常的序列比对。对异常的测序峰图( 例如碱基的突变、缺失、插入等)进行重复实验并且双向测序验证结果。

1.3 临床表现

3代共10人，包括男4人，女6人，为典型的常染色体显性遗传。参与此次研究的家系成员抽取血样5份，其中患者3份，正常成员2份。患病成员均为出生后即存在的双眼晶状体混浊，影响视功能，随年龄增长视力下降渐重。临床检查为核型白内障。无其他眼部疾病及全身性疾病史。(见图1)

图1

1.4 序列分析

家系中3名患者CRYBA4基因的4号外显子第281位发生了T→C的突变，从而导致了有CRYBA4编码的蛋白第94位苯丙氨酸被丝氨酸所取代。该位点被polyphen2在线软件预测为“possiblydamaging”，因此c.225G>T也可能具有一定的致病性(图2)通过NCBIhomogene数据库比对CRYBA4基因同源蛋白的氨基酸序列，我们发现CRYBA4基因第94个氨基酸苯丙氨酸为高度保守的氨基酸序列，具体的比对见图3。

图2

图3

2 讨论

晶体蛋白是晶状体中含量最丰富的结构蛋白，占晶状体内溶解性蛋白质的90%，是纤维细胞失去细胞核后，合成的稳定的非再生的高浓度的晶状体蛋白，介导了晶状体高折射率，对晶状体的透明性和屈光性起重要的作用。因此任何能改变蛋白质空间构象，改变蛋白溶解度，使可溶性蛋白质沉淀、析出均能介导白内障的发生。通过对该先天性白内障家系CRYBA4基因的筛查，我们检测到该家系两名患者的DNA中，位于CRYBA4基因外显子上c.281T>C的突变，并由此导致了βA4晶状体蛋白第94位的苯丙氨酸被丝氨酸取代，而在家系中其他正常成员和100名正常对照者的CRYBA4基因中并未发现该突变。从而，我们推测，位于CRYBA4第四外显子上的c.281T>C突变与这个家系的患病有关。苯丙氨酸具有疏水性，但是丝氨酸具有亲水性，此外苯丙氨酸属于芳香族氨基酸，但是丝氨酸则是脂肪族氨基酸，因此二者的结构和功能具有重大的差异。极性氨基酸丝氨酸，具有很强的亲水性，易与周边氨基酸形成大量的氢键，因而具有很强的绑定功能。因此丝氨酸代替苯丙氨酸后，能和磷酸骨架或周围的氨基酸形成较多的氢键，影响蛋白的稳定性或减少了与其他蛋白质的结合。这可能预示着该段区域的碱基改变在先天性白内障的发病中起着重要作用。该家系患者第281位碱基C取代了T，导致CRYBA4蛋白第94位的苯丙氨酸被丝氨酸所取代。上述氨基酸的改变会使蛋白质的正常的二级结构发生，破坏了该蛋白的稳定性。由于晶体蛋白之间的相互作用，β-A4晶状体蛋白的异常，也会导致其他蛋白的表达发生变化，这一系列的异变发生在晶状体的发育过程中，最终不能形成正常规则排列的透明晶状体，可能引起白内障的发生。该突变位点在白内障星晨个中作用需要进一步的动物实验予以证实。

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The analysis of mutations in an Chinese family with congenital cataract

WANGHai-feng1,ZHANGNa2,WANGZun-jing3

(1. Ophthalmology Department, People’s Hospital in Linkou County, Linkou 157600, China; 2. Ophthalmology Department, the Second Affiliated Hospital of Haerbin Medical University, Haerbin 150007,China; 3. Ophthalmology Department, the Second People’s Hospital in Mudanjiang City, Mudanjiang 157000, China)

Objective: To identify mutations in an Chinese family with congenital cataract .Methods: Venous blood was collected from family members to extract DNA.Ten different genes were identified as the cause of autosomal congenital nuclear cataract,which were screened by PCR amplification and sequencing.Results: We identified a c.281T>C sequence change which led to an amino acid substitutions in the CRYBA4 induced protein in the three patients of this family, and did not detect in the other individuals.Conclusion: One mutation iss discovered, while further study is required to determine the effect of congenial cataract.

congrnital cataract;mutataion;sequence analysis

王海峰(1973～)男，黑龙江林口人，本科，副主任医师。

王海峰1，张娜2，王遵敬3

1008-0104(2015)03-0153-02

2014-12-20)