谢建伟， 黄昌明， 郑朝辉， 李　平， 王家镔， 林建贤

CD44v6在胃神经内分泌癌中的表达及其意义

谢建伟， 黄昌明， 郑朝辉， 李平， 王家镔， 林建贤

摘要:目的探讨肿瘤干细胞表面标记物CD44v6在胃神经内分泌癌中的表达及其意义。方法免疫组织化学方法检测50例胃神经内分泌癌组织和相应癌旁组织中CD44v6蛋白的表达情况，分析CD44v6与胃神经内分泌癌临床病理特征及预后之间的关系。结果CD44v6在胃神经内分泌癌中的表达率为52.0%，在癌旁组织中未见表达，两者差别有统计学意义(P<0.05)。CD44v6与浸润深度、N分期、TNM分期和细胞类型相关。CD44v6表达阳性与表达阴性患者术后5年生存率分别为19.4%和54.2%，差别有统计学意义(P<0.05)。单因素分析提示，浸润深度、N分期、TNM分期、CD44v6高表达是影响患者预后的相关因素；多因素分析提示，CD44v6高表达和N分期为胃神经内分泌癌的独立预后因素。结论CD44v6参与胃神经内分泌癌浸润和淋巴结转移过程，可能是治疗胃神经内分泌癌的潜在靶点之一。

关键词:胃肿瘤； 癌,神经内分泌； 干细胞； 生物学标记； 抗原，CD44； 预后

作者单位: 福建医科大学 附属协和医院胃外科，福州350001

胃神经内分泌癌是胃癌中较为罕见的一种，具有强烈的侵袭和转移特性，预后差[1-4]。胃癌干细胞在胃癌的发生、发展、复发和转移中扮演重要角色[5-6]。有研究表明，肿瘤干细胞表面标志物CD44v6可介导细胞之间、细胞与基质之间的特异性识别、粘附作用，增强肿瘤细胞的趋化行为，促进肿瘤的浸润转移[7-8]。目前，CD44v6在胃神经内分泌癌中的作用尚不十分清楚。本研究通过免疫组织化学检测胃癌组织中CD44v6蛋白的表达，探讨CD44v6与胃神经内分泌癌患者临床病理特征及预后之间的关系。

1资料与方法

1.1一般资料收集2006年1月-2010年6月行根治性手术切除的胃神经内分泌癌标本50例，男性30例，女性20例，年龄中位数60.64岁(38～82岁)；小细胞神经内分泌癌20例，大细胞神经内分泌癌30例；行根治性全胃切除34例，根治性远端胃大部切除16例。TNM分期[9]:Ⅰ期0例 ，Ⅱ期13例，Ⅲ期37例，Ⅳ期0例。患者的临床病理资料采用“胃癌外科临床数据管理与分析系统”进行收集[10]。确诊主要依据H-E染色下细胞的形态特点和免疫组织化学特异的神经内分泌标记，包括嗜铬颗粒蛋白A(chromogranin A，CGA)、突触素(synaptophysin，SYN)、神经元特异性烯醇化酶(neuro specific enoclase，NSE)和CD56。患者术前均未行放、化疗。

1.2方法

1.2.1免疫组织化学染色常规石蜡包埋切片，H-E染色，每例癌组织旁均有邻近非癌组织(距离肿瘤≥5 cm处)作为对照。免疫组织化学染色采用SP法。广谱二抗试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；鼠抗人CD44v6单克隆抗体(英国Abcam公司)。免疫组织化学染色程序按试剂盒说明书进行，主要包括10%中性福尔马林固定、石蜡包埋、4 μm连续切片、常规脱蜡至水、抗原修复、3% H2O2阻断内源性过氧化物酶、山羊血清封闭、滴加一抗后4 ℃过夜、二抗及链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物、DAB显色、对比染色封片。CD44v6的稀释比为1∶2 000，以PBS代替一抗作阴性对照。

1.2.2结果判定CD44v6以细胞质出现棕黄色颗粒为阳性。根据染色程度和染色细胞百分率进行评定和分析：不着色为0分，浅粉色或黄色为1分，粉色或棕黄色为2分，红色或黄褐色为3分；着色细胞占计数细胞的百分率低于5%记0分，5%～24%记1分，25%～50%记2分，>50%记3分。由2位资深病理科医师双盲下独立进行结果判定。在低倍镜下(×40)每张切片随机观察5个视野，所得结果取平均数，将染色程度与染色细胞百分率得分相乘，其乘积为最后得分。0～1分为阴性(-)，2～3分为弱阳性(+)，4～6分为中等阳性()，>6分为强阳性()，其中(-)和(+)定为阴性，()和()定为阳性[11]。

1.2.3随访情况术后随访由专人负责，采用门诊、电话、信件、上门等方式进行，随访频率为患者术后2年内，每3月随访1次，2年后每6～12月随访1次。记录的生存时间为手术时间至末次随访时间，或死亡时间,或随访数据库截止的时间(2015年5月)。

1.3统计学处理采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析。计量资料的比较采用t检验，计数资料的比较采用χ2检验或Fisher精确概率检验。用Spearman方法对CD44v6与临床病理特征相关性进行分析；用Life-Table法进行生存分析。Kaplan-Meier法制作生存曲线，生存率的比较采用Log-rank法检验。应用Cox比例风险回归模型进行多因素分析。

2结果

2.1CD44v6蛋白在胃神经内分泌癌中的表达CD44v6主要表达在胃神经内分泌癌组织的细胞质，阳性表达率为52.0%(26/50)，癌旁组织不表达，两者差别有统计学意义(χ2=31.58，P=0.005，图1)。

A：CD44v6在胃神经内分泌癌组织阳性表达；B：CD44v6在癌旁组织阴性表达.图1　CD44v6在胃神经内分泌癌及癌旁组织中的表达(　×200)Fig 1　The expression of CD44v6 protein in gastric neuroendocrine cancer and non-cancerous tissues (　×200)

2.2CD44v6蛋白表达与临床病理特征的关系CD44v6表达与浸润深度、N分期、TNM分期及细胞类型相关，而与性别、年龄、肿瘤直径、肿瘤部位、手术方式无关(表1)。

2.3CD44v6蛋白表达与患者预后的关系全组患者的中位生存时间为48月，术后5年生存率为38.7%(图2A)。CD44v6蛋白表达阳性与表达阴性患者的中位生存时间分别为25和48月，术后5年生存率分别为19.4%和54.2%，差别有统计学意义(P<0.05，图2B)。单因素分析提示,CD44v6高表达、浸润深度、N分期和TNM分期与预后密切相关。多因素分析提示,CD44v6高表达和N分期为胃神经内分泌癌的独立预后因素(表2)。

表1CD44v6蛋白表达与胃神经内分泌癌临床病理特征的关系

Tab 1Correlation between CD44v6 expression and clinical variables of gastric neuroendocrine cancer patients

临床病理参数nCD44v6n阳性χ2P性别0.8550.355 男3014 女2012年龄/岁0.0870.768 ≤602613 >602413d肿瘤/cm1.2020.273 ≤63118 >6198肿瘤部位5.1290.077 胃上部2517 胃中部145 胃下部114细胞类型6.4640.020 小细胞206 大细胞3020浸润深度5.9530.015 T1~T281 T3~T44225淋巴结转移10.4220.001 N0163 N13423TNM分期4.2760.039 Ⅱ144 Ⅲ3622手术方式1.9820.159 TG3420 DG166

TG：根治性全胃切除；DG：根治性远端胃大部切除.肿瘤直径平均值(6.0 cm)；根据NCCN临床实践指南(2014)将N分期分为N0和N1.

3讨论

CD44是一种跨膜糖蛋白，属于黏附分子家族，是透明质酸主要的细胞表面受体。2009年首次被发现为胃癌干细胞表面标记物并可用于识别胃癌干细胞，参与胃癌细胞的粘附、迁移和侵袭[12]。近来研究发现，CD44与肿瘤的侵袭和转移密切相关，从而被认为是肿瘤转移相关基因[13]。变异型CD44由变异的外显子v1~v10构成，其中以含有外显子v6的CD44变异体即CD44v6与肿瘤侵袭、转移的关系最为密切。在一项关于黏膜下胃癌的研究中，Okayama等发现，CD44v6是显示淋巴结转移的唯一指标[7]。笔者前期在胃腺癌的研究也发现，CD44v6与浸润深度、淋巴结转移、Lauren分型和TNM分期密切相关。CD44v6阳性的患者5年生存率较阴性患者差(38.8%vs73.6%)[14]。本研究发现,CD44v6在胃神经内分泌癌中的表达率明显高于癌旁组织(P<0.05)。CD44v6与浸润深度、N分期、TNM分期和细胞类型相关。这些结果再次证实，在不同病理类型的胃癌中，CD44v6都参与肿瘤的浸润、转移和侵袭，推测对CD44v6的研究可能具有较好的潜在临床应用价值。

表250例胃神经内分泌癌患者Cox模型多因素预后分析

Tab 2Multiple stepwise regression analysis with the Cox proportional hazards model of gastric neuroendocrine cancer patients

临床病理指标回归系数标准误WaldP相对危险度95%CITNM分期0.3420.5020.4640.4961.4080.526~3.765浸润深度0.7391.0530.4930.4832.0930.266~16.473N分期2.2891.0694.5850.0329.8701.214~80.252CD44v6表达1.2260.5435.0970.0243.4071.175~9.875

A：全组患者生存曲线；B：CD44v6表达阳性组和阴性组生存曲线的比较(P=0.000).图2　50例胃神经内分泌癌患者预后Fig 2　The prognosis of 50 gastric neuroendocrine cancer patients with lymph node metastasis and CD44v6 expression

胃神经内分泌癌是一种少见的胃癌，绝大多数患者在诊断时已为进展期或晚期。目前临床上多采用以手术为主的综合治疗，其预后较一般胃腺癌更差[15]。本研究发现，CD44v6表达阳性患者预后明显较表达阴性患者差(P<0.05)。单因素和多因素分析也提示，CD44v6高表达为胃癌的独立预后因素之一，说明CD44v6表达阳性有助于早期判断胃神经内分泌癌的预后。

综上所述，肿瘤干细胞表面标记物CD44v6与胃神经内分泌癌进展、转移和侵袭能力密切相关。本研究结果将为进一步研究CD44v6的功能及作用机制提供理论依据，也为胃癌神经内分泌癌靶向治疗提供思路。

参考文献：

[1]Kloppel G. Classification and pathology of gastroenteropancreatic neuroendocrine neoplasms[J].EndocrRelatCancer, 2011,18(1):S1-S16.

[2]Ishida M, Sekine S, Fukagawa T,etal. Neuroendocrine carcinoma of the stomach: morphologic and immunohistochemical characteristics and prognosis[J].AmJSurgPathol, 2013,37:949-959.

[3]Matsui K, Jin X M, Kitagawa M,etal. Clinicopathologic features of neuroendocrine carcinomas of the stomach: appraisal of small cell and large cell variants[J].ArchPatholLabMed, 1998,122:1010-1017.

[4]Jiang S X, Mikami T, Umezawa A,etal. Gastric large cell neuroendocrine carcinomas: a distinct clinicopathologic entity[J].AmJSurgPathol, 2006,30:945-953.

[5]Eto S, Yoshikawa K, Shimada M,etal. The relationship of CD133, histone deacetylase 1 and thrombospondin-1 in gastric cancer[J].AnticancerRes, 2015,35(4):2071-2076.

[6]Choi Y J, Kim N, Chang H,etal. Helicobacter pylori-induced epithelial-mesenchymal transition, a potential role of gastric cancer initiation and an emergence of stem cells[J].Carcinogenesis, 2015,36(5):553-563.

[7]Okayama H, Kumamoto K, Saitou K,etal. CD44v6, MMP-7 and nuclear CDX2 are significant biomarkers for prediction of lymph node metastasis in primary gastric cancer[J].OncolRep, 2009,22(4):745-755.

[8]Wang J, Xiao L, Luo C H ,etal. CD44v6 promotes β-catenin and TGF-β expression, inducing aggression in ovarian cancer cells[J].MolMedRep, 2015,11(5):3505-3510.

[9]Massironi S, Sciola V, Peracchi M,etal. Neuroendocrine tumors of the gastro-entero-pancreatic system[J].WorldJGastroenterol, 2008,14(35):5377-5384.

[10]Hu Y F, Yu J, Zhang C,etal. Development and implementation of a clinical data mining system for gastric cancer surgery (in Chinese) [J].ChinJGastrointestSurg, 2010,13(7):510-515.

[11]谢建伟，黄昌明，郑朝辉，等. CD44v6与胃癌淋巴结转移及预后关系研究[J]. 福建医科大学学报，2015,49(3)：145-148.

[12]Takaishi S, Okumura T, Tu S,etal. Identification of gastric cancer stem cells using the cell surface marker CD44[J].StemCells, 2009,27(5):1006-1020.

[13]Steinert A F, Kunz M, Prager P,etal. Characterization of bursa subacromialis-derived mesenchymal stem cells[J].StemCellResTher,2015,6(1):114.

[14]Xie J W, Chen P C, Zheng C H,etal. Evaluation of the prognostic value and functional roles of CD44v6 in gastric cancer[J].JCancerResClinOncol, 2015, Mar 26. [Epub ahead of print].

[15]Okita Tsuda N, Kato K, Takahari D,etal. Neuroendocrine tumors of the stomach: chemotherapy with cisplatin plus irinotecan is effective for gastric poorly-differentiated neuroendocrine carcinoma[J].GastricCancer, 2011,14(2):161-165.

(编辑：何佳凤)

《福建医科大学学报》

双月刊CN 35-1192/R邮发代号 34-66

欢迎投稿欢迎订阅

The Expression and Clinical Value of CD44v6

in Gastric Neuroendocrine Carcinoma

XIE Jianwei, HUANG Changming, ZHENG Chaohui, LI Ping, WANG Jiabin, LIN Jianxian

Department of Gastric Surgery, Fujian Medical University Union Hospital, Fuzhou 350001, China

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the expression and significance of tumor stem cell surface marker CD44v6 in gastric neuroendocrine carcinoma.MethodsWe identified the expression of CD44v6 protein in 50 cases of resected gastric neuroendocrine carcinoma tissues and corresponding peritumoral tissues by immunohistochemistry, to investigated the association between the expression and the clinicopathologic factors and prognosis.ResultsThe expression rate of CD44v6 was significantly greater in gastric neuroendocrine carcinoma than in peritumoral tissues (52.0% vs 0, P<0.05), The expression of CD44v6 was related to depth of invasion, lymph node metastasis, TNM stage and cell classification.The 5-year survival rates of patients with positive and negative expression were 19.4% and 54.2%(P<0.05), respectively.Univariate analysis showed that the prognosis was significantly correlated with depth of invasion, lymph node metastasis, TNM stage, tumor size, and high CD44v6 expression.But only high CD44v6 expression and lymph node metastasis were independent prognostic factors on multivariate analysis.ConclusionsCD44v6 plays an important role in invasion and lymph node metastasis, and may serve as one of the potential therapeutic target of gastric neuroendocrine carcinoma.

KEY WORDS:stomach neoplasms; carcinoma, neuroendocrine; stem cells; biological markers; antigens, CD44; prognosis

通讯作者:黄昌明. Email:hcmlr2002@163.com

作者简介:谢建伟(1979-)，男，副主任医师，医学硕士

基金项目:国家自然科学基金(81441123)；中国临床肿瘤学科学基金(Y-N2014-008)；福建省自然科学基金(2014J01322)

收稿日期:2015-06-16

中图分类号:R341.32； R392.11； R735.2； R977.6

文献标志码:A

文章编号:1672-4194(2015)05-0280-04