任红英，赵钦军，王彤，程雪莲，程涛(中国医学科学院血液学研究所，实验血液学国家重点实验室，天津300020)

不同缺氧条件对小鼠骨髓基质细胞成分组成和细胞分化的影响

任红英，赵钦军，王彤，程雪莲，程涛(中国医学科学院血液学研究所，实验血液学国家重点实验室，天津300020)

摘要：目的观察不同缺氧条件对小鼠骨髓基质细胞(BMSC)成分组成的影响。方法Balb/c小鼠15只脱颈处死，取双侧股骨，分离BMSC接种于T25培养瓶中。将细胞随机分为对照组、缺氧1组、缺氧2组、氯化钴组。各组细胞分别以低密度(5×102/cm2)、中密度 (1×104/cm2)、高密度 (1.5×106/cm2)接种于培养基。对照组置于常氧条件(37 ℃、5% CO2、21%O2)培养，缺氧1组于2.5%～4%O2、5%CO2、91%～92.8%N2条件下培养，缺氧2组置于7%～8%O2、5%CO2、87%～88%N2条件下培养。氯化钴组在培养基中加入氯化钴 100 μΜ/L。各组细胞培养7 d后观察结果。光镜及透射电镜下观察BMSC细胞形态和超微结构变化，免疫组化法检测细胞中碱性磷酸酶(ALP)表达，RT-PCR法检测OCT4及内皮细胞相关基因(VEGF、FLT-1、FLK-1)表达。结果对照组以梭形成纤维样细胞为主，少有细胞融合现象；缺氧1、2组出现较多个体较大、扁平而宽阔的骰子样细胞；氯化钴组细胞呈圆形，个体较小。缺氧1组BMSC增殖率高于缺氧2组；中密度接种细胞增殖率最高；氯化钴组细胞增殖受到明显抑制。缺氧1、2组ALP染色阳性细胞多于对照组及氯化钴组，且缺氧1组高于缺氧2组(P均<0.05)。缺氧1、2组OCT4基因表达受到抑制，仅对照组及氯化钴组OCT4基因表达阳性。VEGF在缺氧1、2组表达均为阴性，而在氯化钴组表达阳性；各组FLK-1基因表达均为阳性；FLT-1基因表达均为阴性。结论在2.5%～4%O2、1×104/cm2接种密度条件下，小鼠BMSC中一种分化程度较高、宽阔、扁平、ALP表达阳性的细胞比例进一步增高。

关键词：缺氧；骨髓基质细胞；细胞分化

骨髓基质细胞(BMSC)是一群成分复杂的混合细胞，由两群形态差别较大的细胞组成，一群为纺锤样的长梭形细胞(RS)；另一群细胞个体较大，形态扁平、宽阔呈骰子形，这群细胞被认为分化程度较高。正常氧(21% O2)条件下培养时，前者占绝大多数，后者比例很小[1]，但后者细胞个体较大、胞质伸展，是许多造血细胞黏附、增殖和形成克隆的重要场所。因此，将该类细胞从骨髓中分离出来，研究其生物学特点和功能，将为骨髓造血调控研究提供重要依据。我们前期研究发现，缺氧培养可使小鼠BMSC中这类形态扁平、宽阔、个体较大的细胞比例增高，同时该类细胞碱性磷酸酶(ALP)染色阳性[2]。2010年8月～2014年10月，我们观察了不同缺氧条件对BMSC成分组成的影响，以期获得更高比例的目标细胞，现报告如下。

1材料与方法

1.1实验动物与材料Balb/c小鼠15只，8～12周龄，雌雄各半(中国医学科学院动物中心提供)。IMDM培养基购自Gibco公司。胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(trypsin)为Hyclone公司产品。ALP检测试剂盒购自中国医学科学院血液学研究所科技公司。

1.2实验方法

1.2.1小鼠BMSC的分离 Balb/c小鼠脱颈处死，消毒后取双侧股骨，自中间剪断后用IMDM冲出骨髓细胞，计数并调整细胞密度，接种于T25培养瓶中。分别置于37 ℃、5% CO2、21%O2常氧条件和不同浓度缺氧条件下培养，24 h后倾倒悬浮细胞上清液。以后每2～3 d半量换液。待原代培养的细胞铺满整个培养瓶底的70%～80%开始传代培养。流式细胞术行CD44、CD29、CD34、CD31、CD45表型检测以鉴定BMSC[2]。

1.2.2细胞分组与处理将BMSC随机分为对照组、缺氧1组、缺氧2组、氯化钴组。各组细胞分别以低密度(5×102/cm2)、中密度(1×104/cm2)、高密度(1.5×106/cm2)接种于培养基(IMDM+10%FBS)。对照组置于常氧条件(37 ℃、5% CO2、21%O2)培养。缺氧1组将原代培养的BMSC置于密闭缺氧罐中注入2.5%～4%O2、5%CO2、91%～92.8%N2的混合气体5 L/min×5 min，夹闭5 min后再次通气，如此反复3次后夹闭，将密闭缺氧罐置于37 ℃、5%CO2孵箱内培养到指定时间。缺氧2组置于7%～8%O2、5%CO2、87%～88%N2条件下培养，操作过程参考缺氧1组。氯化钴组在培养基中加入氯化钴 100 μΜ/L。各组细胞培养7 d后观察结果。

1.2.3细胞形态及超微结构观察普通光学显微镜下观察BMSC细胞形态。收集原代培养7 d的细胞悬液以2 000 r/min离心10 min，使细胞成团，经2．5%戊二醛前固定，1%锇酸后固定，乙醇系列脱水，Epon812包埋及LKB-11超薄切片机切片，在JEOL-1200EX透射电镜下观察并拍照，观察细胞超微结构。

1.2.4细胞增殖测定每天在倒置显微镜下观察细胞形态，培养7 d，将各组BMSC消化后采用胎盘蓝拒染实验计数，并与对照组进行比较，计算细胞增殖率=实验组细胞计数-对照组细胞数/对照组细胞数×100%。

1.2.5细胞ALP检测将BMSC原代培养8～9 d的盖玻片取出，0.1 mmol/L PBS洗涤2次。用吹风机快速吹干，并以4%多聚甲醛固定10 min后，采用免疫组化法检测ALP，严格按说明书操作。ALP阳性染色主要位于BMSC中一种个体较大的扁平细胞质内，胞质呈淡紫色染色为阳性结果，呈黄色为阴性结果。

1.2.6OCT4基因及内皮细胞相关基因检测MSC培养7 d后，采用RT-PCR法检测。提取各组细胞总RNA，OCT4基因上游引物序列为5′-TGGCATACTGTGGACCTCAGGTT-3′，下游引物序列为5′-TTTCCAAAGAGAACGCCCAGGG-3′，扩增产物长度为319 bp；FLT-1上游引物序列为 5′-TGTGGAGAAACTTGGTGACCT-3′，下游引物序列为 5′-TGGAGAACAGCAGGACTCCTT-3′，产物长度504 bp;FLK-1 上游引物序列为5′-AGAACACCAAAAGAGAGGAACG-3′，下游引物序列为 5′-GCACACAGGCAGAAACCAGTAG-3′，产物长度383 bp; VEGF上游引物序列为5′-GCAGGCTGCTGTAACGATGAAG-3′，下游引物序列为5′-CAAGGCTCACAGTGATTTTCTGGC-3′，产物长度185 bp。PCR条件为：93 ℃预变性3 min，随后93 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共进行35个循环，再于72 ℃延伸7 min。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

1.3统计学方法采用SPSS10.0统计软件分析。率的比较用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1细胞形态与超微结构光镜下对照组以梭形成纤维样细胞为主，少有细胞融合现象；缺氧1组、缺氧2组出现较多个体较大、扁平而宽阔的骰子样细胞；氯化钴组细胞呈圆形，个体较小。电镜下(4 000×)，对照组细胞核以梭形为主，细胞以较长的梭形形态居多，BMSC超微结构清晰，线粒体嵴排列规则，异染色质均匀；缺氧1、2组细胞形态扁平、宽阔者比例较高，以宽阔、圆形细胞核为主，且核仁较大，多数细胞表现为分化程度增高，细胞器相对完整，细胞质内空泡明显增多；氯化钴组细胞形态较小，细胞核圆形，细胞内空泡很少。

2.2细胞增殖率在BMSC不同接种密度条件下，细胞增殖率有明显差别，以中密度(1×104/cm2)接种者细胞增殖最为明显，缺氧1组细胞增殖率高于缺氧2组；而氯化钴组增殖受到明显抑制。详见表1。

组别细胞增殖率低密度接种中密度接种高密度接种缺氧1组19.6±14.240.1±4.7#*7.8±4.5#缺氧2组10.2±4.127.2±4.7*4.8±3.7氯化钴组0-65.3±5.3-73.3±8.9

注：与缺氧2组同一密度相比，#P<0.05；与同组低、高密度接种者相比，*P<0.05。

2.3ALP及OCT4基因表达缺氧1组、缺氧2组ALP阳性细胞率高于对照组及氯化钴组，且缺氧1组高于缺氧2组，氯化钴组低于对照组(P均<0.05，见表2)。缺氧1、2组OCT4基因表达受到抑制，仅对照组及氯化钴组OCT4基因表达阳性。

组别ALP染色阳性细胞率低密度接种中密度接种高密度接种缺氧1组5.8±1.621.60±2.3*#10.40±2.3*缺氧2组3.8±1.411.50±1.9*6.80±2.5氯化钴组- 0.48±0.0*0.29±0.1对照组1.9±0.34.50±0.42.80±0.5

注：与对照组同一密度组相比，*P<0.05；与缺氧1组、缺氧2组同一接种密度组相比，#P<0.05。氯化钴低密度接种组由于大部分细胞突起脱落，活细胞数目少，故未计算数据。

2.4内皮细胞相关基因表达VEGF在缺氧1、2组表达均为阴性，而在氯化钴组表达阳性；各组FLK-1基因表达均为阳性，FLT-1基因表达均为阴性。各组内皮细胞相关基因表达差异不大。

3讨论

ALP染色在血细胞特征研究中有重要作用[10]，正常的BMSC中ALP表达较少,而缺氧促进该类细胞中ALP高表达，ALP高表达与细胞分化程度增高相一致。ALP检测可能成为纯化目标细胞的一种方法。本研究中，缺氧1组较缺氧2组、对照组BMSC中ALP阳性率升高，说明该缺氧条件可使ALP阳性表达的细胞增多。OCT4基因是未分化细胞的重要标志，在胚胎干细胞和BMSC中均有表达[11,12]，由于早期的MSC还包括第三群细胞即非常小的圆形细胞，具有快速自我更新能力[1]，其可能与BMSC OCT4基因表达阳性有关。本研究发现，缺氧1、2组OCT4基因表达丢失，而缺氧模拟物氯化钴不能抑制OCT4基因表达，说明缺氧促进了BMSC的分化，而氯化钴没有该作用。

缺氧能上调许多基因表达，特别是与血管新生和造血有关的基因表达[13,14]。缺氧可促进血管新生，使内皮细胞增殖，而骨髓基质中有内皮细胞存在，有报道1% O2处理可诱导BMSC中VEGF表达和血管形成[15,16]。本研究结果显示，各组BMSC均表达FLK-1基因，该基因产物VEGF2受体在介导VEGF促进内皮细胞分化、增殖及造血细胞发育方面起重要作用。FLK-1基因在BMSC中表达，说明在合适的外界刺激下，BMSC有分化成内皮细胞从而形成血管的潜能。我们进一步观察发现，3% O2处理的BMSC并不表达VEGF基因，从而无法诱导血管形成。但缺氧模拟物氯化钴处理却能使VEGF基因表达上调，所以氯化钴具有一定的模拟缺氧的作用。FLT-1基因与内皮细胞重排和血管平滑肌细胞增殖有关，各组FLT-1基因表达均为阴性表明骨髓中多以血窦为主，而真正有功能的血管形成需要多种因素参与，特别是细胞外基质成分共同作用。因此，不同缺氧浓度的选择对BMSC分化和细胞成分组成的影响不同，氯化钴亦不能完全模拟缺氧的作用。

总之，本研究设定了不同的缺氧培养条件，从BMSC中获得更高比例宽阔、扁平及ALP表达阳性的细胞，并证明该类细胞能够在较低的缺氧条件下增殖。综合本研究结果，我们认为3%～4%O2、1×104/cm2细胞接种密度对于BMSC分化筛选效果更好。然而，对于目标细胞缺氧耐受性产生的机制仍不清楚，今后有望通过深入研究缺氧条件下BMSC中表面分子和信号通路的变化来阐明其耐受原因，进一步了解缺氧对BMSC的影响，寻找更合理的纯化目标细胞的方法。

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Effect of different hypoxic conditions on the cell constituents of murine bone marrow stromal cells

RENHong-ying,ZHAOQin-jun,WANGTong,CHENGXue-lian,CHENGTao

(StateKeyLaboratoryofExperimentalHematology,InstituteofHematologyChinese

AcademyofMedicalSciences,Tianjin300020,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effects of different hypoxic conditions on the cellular constituents of mice bone marrow stromal cells (BMSC). MethodsFifteen Balb/c mice were taken off the neck to death, and bone marrow were collected from the femoral diaphysis. The isolated BMSC were plated in T25 culture flasks. The isolated bone marrow cells were randomly divided into control group, hypoxia 1 group, hypoxia 2 group, and COCl2group. BMSC in each group were seeded at low density(1×102/cm2), medium density(1×104/cm2), and high density(1×106/cm2) in culture medium. The control group cell was cultured at normoxic conditions(37 ℃，5% CO2，21%O2). The hypoxia 1 group cell was cultured at 2.5%～4%O2, 5%CO2and 91%～92.8%N2. The hypoxia 2 group cell was cultured at 7%～8%O2, 5%CO2, 88%～87%N2, as well as 100 μmol/L COCl2was added in COCl2group. The culture results were observed 7 days after seeding. The morphology and ultrastructure of BMSC were observed by light microscope and transmission electron microscope, and the expression of ALP was analyzed by immunohistochemistry. The OCT4 gene and endothelial cells relative genes (VEGF, FLT1, FLK1) were detected by RT-PCR. ResultsThe number of cells in hypoxic 1 group significantly increased compared to the control group and hypoxia 2 group, while COCl2inhibited the proliferation of BMSC. The morphology of BMSC in hypoxic group was wide, flat and big. The ultrastructure analysis showed that there were more vacuoles after under hypoxic conditions than the number under normoxic conditions. The proportion of ALP positive cells in BMSC under hypoxic culture increased compared to that under control group and hypoxia 2 group. However, the morphology of BMSC was small and round after COCl2treatment, and no ALP positive cells existed in COCl2group. Furthermore，hypoxia inhibited the expression of OCT4 gene, and can not increase the expression of endothelial cells relative genes such as VEGF, FLT1 and FLK1. Conclusion When plated at 1×104/cm2density under 2.5% to 4%O2concentration, a kind of BMSC cell type, which was wide, flat, ALP positive and high differentiated cell increased in the proportion of BMSC.

Key words:hypoxia; bone marrow stromal cells; differentiation

(收稿日期：2014-11-03)

作者简介：第一任红英(1976-)，女，硕士，副研究员，研究方向为缺氧和造血微环境。E-mail: hongying.ren@yahoo.com

基金项目：国家自然科学基金青年基金资助项目(81000196)。

中图分类号：Q813

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2015)02-0020-04

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.02.007