吴瑗(广东医学院微生物与免疫学教研室，广东湛江524023)

苦参碱对炎症状态下肾小管上皮细胞B7-H1 mRNA及蛋白表达的影响

吴瑗(广东医学院微生物与免疫学教研室，广东湛江524023)

摘要：目的探讨苦参碱对炎症状态下肾小管上皮细胞B7-H1 mRNA及蛋白表达的影响。方法取人肾小管上皮细胞(HK-2)用于实验。 ①苦参碱浓度对B7-H1的影响：设对照组、模型组及苦参碱低、中、高剂量组，对照组仅加含5%胎牛血清的DMEM培养液，模型组及苦参碱低、中、高浓度组加入终浓度为100 g/L的IFN-γ，苦参素低、中、高浓度组再分别加入0.5、0.8、1.0 g/L的苦参碱；培养24 h，采用RT-PCR法检测HK-2细胞中的B7-H1 mRNA，流式细胞术检测B7-H1蛋白。②苦参碱干预时间对B7-H1的影响：设对照组、模型组及苦参碱不同培养时间组(12、16、24 h)，对照组仅加含5%胎牛血清的DMEM培养液培养24 h，模型组加终浓度为100 g/L的IFN-γ培养24 h，苦参碱12 h、16 h、24 h组加入终浓度为100 g/L的IFN-γ和0.8 g/L的苦参碱，分别培养12、16、24 h，采用RT-PCR法检测HK-2细胞中的B7-H1 mRNA。结果 模型组B7-H1 mRNA及其蛋白表达量高于对照组，苦参碱低、中、高浓度组低于模型组(P均﹤0.05)；苦参碱12 h、16 h、24 h组B7-H1 mRNA及其蛋白表达低于模型组(P均﹤0.05)。苦参碱抑制HK-2细胞B7-H1 mRNA表达作用呈剂量、时间依赖性，对B7-H1蛋白的抑制作用也呈剂量依赖性(P均﹤0.05)。结论 IFN-γ诱导的炎症状态下肾小管上皮细胞B7-H1 mRNA、蛋白表达增高，苦参碱可下调B7-H1 mRNA、蛋白表达。

关键词：苦参碱；肾小管上皮细胞；B7-H1基因;协同刺激分子

苦参碱是一种从传统中草药苦参中提取出来的苦参型生物碱。研究发现，苦参碱不仅具有抗炎、抗肿瘤、抗心律失常、抗肝脏纤维化及免疫调节作用[1～3]，对肾脏亦有一定的保护作用[4，5]，但确切机制未明。肾小管上皮细胞(TEC)和T淋巴细胞参与的细胞免疫是肾小管间质病变的重要环节。T细胞活化不仅需要第一信号(抗原肽-MHCⅠ/Ⅱ复合物)，亦需要第二信号(协同刺激信号)。有文献报道，TEC作为抗原提呈细胞，可表达协同刺激分子(如CD40、B7RP-1等)，提供T细胞活化的第二信号[6]。B7-H1是最近发现的协同刺激分子，其配体为PD-1。目前研究证实PD-1/B7-H1通路在多种自身免疫性疾病的发生发展中起重要作用[7，8]。2012年12月～2013年12月，我们观察了苦参碱对IFN-γ诱导的炎症状态下TEC中B7-H1 mRNA及蛋白表达的影响，探讨苦参碱肾脏保护作用的可能机制。

1材料与方法

1.1材料人肾小管上皮细胞株(HK-2)由广东医学院肾脏病研究所惠赠。DMEM培养液及胎牛血清购于美国Gibco公司。苦参碱购自西安中鑫生物科技公司。Trizol试剂、逆转录试剂盒购自Promega公司。SYBR Premix Ex TaqⅡ购自大连TaKaRa生物工程公司。B7-H1及内参照β-actin的引物由上海生工生物工程公司合成。人IFN-γ购自PeproTech公司，PE标记小鼠抗人B7-H1单克隆抗体购自eBioscience公司。倒置相差显微镜(Nikon)，实时定量PCT仪(ABI 7300)，Galios流式细胞仪(Beckman)。

1.2细胞分组与处理①不同苦参碱浓度分组：对照组仅加含5%胎牛血清的DMEM培养液，模型组及苦参碱低、中、高浓度组均加入终浓度为100 g/L的IFN-γ，苦参素低、中、高浓度组再分别加入0.5、0.8、1.0 g/L的苦参碱，细胞培养24 h后检测B7-H1 mRNA及蛋白。②不同苦参碱干预时间分组：对照组仅加含5%胎牛血清的DMEM培养液培养24 h，模型组加入终浓度为100 g/L的IFN-γ培养24 h，苦参碱12 h、16 h、24 h组均加入终浓度为100 g/L的IFN-γ和0.8 g/L的苦参碱，分别培养12、16、24 h。

1.3 HK-2细胞中B7-H1 mRNA及其蛋白检测 ①B7-H1 mRNA：采用RT-PCR法。加入Trizol试剂提取细胞总RNA，取2 μg细胞总RNA进行逆转录反应。B7-H1上游引物为5′-CTGCATGATCAGCTA-TGGTGGTG-3′，下游引物为5′-CAGTTCATGTTCAGA-GGTGACTGGA-3′；内参基因β-actin上游引物为5′-CCATGTACGTTGCTATCCAGG-3′，下游引物为5′-TCTCCTTAATGTCACGCACGA-3′。反应条件：95 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，共40个循环。计算B7-H1 mRNA相对表达量。②B7-H1蛋白：采用直接免疫荧光流式细胞术检测。0.1%胰酶消化细胞，调整细胞浓度为1×106/mL；转入流式管，1×PBS洗2次，弃上清，每管加入100 μL PBS，制成细胞悬液1×106/100 μL，每100 μL细胞悬液中加入小鼠抗人B7-H1单克隆抗体7 μL；冰上避光作用30 min，PBS洗2次细胞，1 500 r/min、4 ℃离心5 min，收集细胞，加入500 μL PBS进行流式细胞仪分析。设小鼠IgG1抗体代替小鼠抗人B7-H1单克隆抗体的同型对照。用Cellquest软件分析HK-2细胞表达B7-H1的平均荧光强度(MFI)，代表B7-H1蛋白表达量。

2结果

2.1不同浓度苦参碱处理后HK-2细胞B7-H1 mRNA及蛋白相对表达量模型组HK-2细胞B7-H1 mRNA及蛋白表达高于对照组，苦参碱低、中、高浓度组均低于模型组(P均﹤0.05)；苦参碱呈剂量依赖性抑制HK-2细胞B7-H1 mRNA、蛋白表达(P均﹤0.05)。见表1。

表1　不同浓度苦参碱处理后HK-2细胞B7-H1 mRNA及

注：与对照组相比，*P<0.05；与模型组比，#P<0.05。

2.2苦参碱处理后不同时间HK-2细胞B7-H1 mRNA相对表达量对照组、模型组及苦参碱12 h、16 h、24 h组HK-2细胞B7-H1 mRNA相对表达量分别为1.00±0.13、2.95±0.07、1.87±0.86、1.32±0.06、0.98±0.03，其中模型组高于对照组，苦参碱12 h、16 h、24 h组低于模型组(P均﹤0.05)。苦参碱呈时间依赖性抑制HK-2细胞B7-H1 mRNA表达(P均﹤0.05)。

3讨论

大量文献报道，在免疫性肾损伤过程中，TEC不仅是受害者，也是炎症损伤的参与者。TEC可能作为一种非专职的抗原提呈细胞提呈抗原，激活T细胞。多项研究结果表明，TEC不表达经典的共刺激分子B7，因此认为在TEC与T细胞相互作用中，可能有另外的共刺激信号分子参与。B7-H1为共刺激分子B7家族的新成员，主要表达于抗原提呈细胞，与表达在T细胞的配体PD-1结合，调控T细胞增殖与分化，在机体免疫耐受中发挥重要作用[9]。而对于B7-H1具体的生物学功能，学者们研究结论不同。文献[8，9]报道B7-H1可抑制T细胞活化，起负性调控作用；而Dong等[10]则报道B7-H1与单克隆抗体结合后可导致类风湿性疾病患者T细胞异常活化。已有研究表明，对B7-H1/PD-1通路进行干预有助于狼疮性肾炎等自身免疫性疾病的治疗[10，11]。本研究结果显示，正常状态下TEC表达少量B7-H1 mRNA及蛋白，而在炎症状态下(IFN-γ诱导)B7-H1表达显著上调，这与De Haij等[12]的研究结果一致。推测TEC表达的B7-H1可能与其周围T细胞上的受体PD-1结合，调控T细胞活化，引起肾小管间质病变。

近年研究发现，苦参碱可抑制多种炎性因子如IL-23、IL-17、TNF-α及黏附分子ICAM-1、VCAM-1等分泌，在防治自身免疫性疾病中发挥重要作用[2，13]。目前苦参碱被应用于肝硬化、心律失常及肿瘤等多种疾病的治疗，但其在肾脏疾病中的治疗作用机制尚未明确。本研究结果显示，苦参碱在一定剂量范围内，可下调HK-2细胞中B7-H1 mRNA、蛋白表达水平，具有一定剂量依赖性，其抑制B7-H1 mRNA表达的作用也呈时间依赖性，提示苦参碱在基因转录及转录后水平均可抑制炎症状态下TEC中B7-H1表达，有望在肾脏疾病的防治中发挥一定作用。至于苦参碱是否通过下调TEC中B7-H1表达从而抑制T细胞活化，达到缓解肾病进展的作用，尚需进一步研究。

另有文献报道，苦参碱可使肾小球系膜增生、硬化程度明显减轻；可抑制NF-κB活化，下调IL-6、TNF-α及MCP-1表达，延缓肾小球硬化及肾小管间质纤维化；还能部分恢复肾小管间质中基质金属蛋白酶-3(MMP-3)、基质金属蛋白酶组织抑制物-1(TIMP-1)、纤维连接蛋白(FN)、结缔组织生长因子(CTGF)的表达，从而延缓肾小管间质纤维化进程[4，5,14]。

分析上述研究结果，苦参碱可能通过多个环节抑制肾脏的炎性病变，在防治肾脏疾病中发挥一定作用。

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Effect of matrine on the expression of B7-H1 in tubular epithelial cells

WUYuan

(DepartmentofMicrobiologyandImmunology,GuangdongMedicalCollege,Zhanjiang524023,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the effect of matrine on expression of B7-H1 in tubular epithelial cells. Methods ①The effect on different dose of matrine: human HK-2 cells were cultured under five culture conditions to observe and divided into 4 groups, which was control group(5% fetal calf serum+DMEM for 24 h), model group (IFN-100 g/L for 24 h), matrine group (IFN-100 g/L+0.8 g/L matrine for 12 h,16 h and 24 h) . The expression of B7-H1 mRNA was evaluated by using real time RT-PCR. The surface expression of B7-H1 on HK-2 was analyzed by using flow cytometry. ②The effect on different time of matrine: cell were divided into control group(5% fetal calf serum+DMEM for 24 h), model group (IFN-100 g/L for 24 h), matrine group (IFN- 100 g/L+0.8 g/L matrine for 12 h,16 h and 24 h). The expression of B7-H1 mRNA was evaluated by using real time RT-PCR. ResultsThe expression of B7-H1 on HK-2 cells was decreased in normal condition. IFN- can significantly increased the expression of B7-H1. Matrine decreased the B7-H1 expression of HK-2 cells in a dose and time dependent way at mRNA levels and in a dose dependent way at protein levels (P<0.05). ConclusionB7-H1 mRNA and protein increased under the condition of inflammation induced by IFN-γ. Matrine could down regulate the expression of B7-H1 mRNA and protein.

Key words:matirne；tubular epithelial cell; B7-H1; co-stimulatory molecule

(收稿日期：2014-12-01)

作者简介：第一吴瑗(1975-)，女，医学硕士，副教授，主要从事免疫性肾疾病的研究。E-mail:717748644@qq.com

基金项目：广东省中医药管理局科研基金资助项目(ZY0904)；广东医学院科研基金面上项目(XK0801)。

中图分类号：R692

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2015)02-0005-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.02.002