张 羽 ，石云良 ，吴文德 ，杨 磊 ，李 健，黄维义，

（1.广西大学动物科学技术学院，广西 南宁530005 ；2.广西大学食品质量与安全研究中心，广西 南宁530005）

犬细小病毒病是由犬细小病毒（Canine parvovirus，CPV）引起的一种常见烈性传染病，具有高发病、高死亡率等特点。断乳前后的仔犬易感性最高，死亡率可达10%～50%。犬巴贝斯虫病是一种蜱传性血液原虫病，由犬巴贝斯虫（Babesia canis）和吉氏巴贝斯虫（B.gibsoni）引起，两者在形态学上有明显差别[1]。根据抗原性质、交叉免疫、血清学试验等可将犬巴贝斯虫分为3 个亚种[2]：犬巴贝斯虫亚种（B.canis canis）、韦氏巴贝斯虫亚种（B.canis vogeli）和罗氏巴贝斯虫亚种（B.canis rossi）。近年来，我国已经有不少关于犬的巴贝斯虫病的报道[3-4]。

笔者于2013 年11 月，对1 只罗威纳病犬进行临床与实验室诊断，发现该犬为犬细小病毒与韦氏巴贝斯虫的混合感染，诊断情况报告如下。

1 发病情况

2013 年11 月，某先生从广西北海市购买1 只幼犬，免疫情况不详，未驱虫。两天后，主诉：该犬精神不振，呕吐，腹泻（3 次），腹泻物为黄色稀便。

2 临床检查

罗威纳病犬，2 月龄，雄性。体温39.9 ℃，精神不振，鼻镜干，可视黏膜苍白，皮肤无弹性，鼻及足垫未见角质化，腹部触诊未见明显异常，体表有蜱虫，皮肤未见明显损伤。

3 实验室检验

3.1 检测试纸法 使用韩国BIT 犬瘟热病毒（CDV）、犬细小病毒（CPV）抗原检测试剂盒、上海快灵犬冠状病毒（CCV）抗原检测试剂盒，根据使用说明书进行取样并检测。

结果：CDV 阴性；CPV 阳性；CCV 阴性。

3.2 血常规检查 对病犬进行静脉无菌采集抗凝血。使用南京普朗全自动血球仪进行血液常规检查，结果如表1。

结果分析：RBC↓、HCT↓表明该病犬可能有贫血；WBC↑表明该犬可能伴有并发症，其中BASON↑、BASOP↑提示可能有寄生虫感染。

表1 血液检查

3.3 PCR 检测

3.3.1 DNA 的提取 将抗凝血滴于Whatman FTA卡片上，使用FTA-DNA 直接提取法提取DNA。

3.3.2 引物的选择 按照翟晓虎[5]报道的根据犬巴贝斯虫18S rRNA 基因设计的犬吉氏巴贝斯虫和犬巴贝斯虫通用引物，预计扩增片段大小为339 bp，由华大基因科技服务有限公司合成，引物序列如下。

上游引物：5′-GTCTTGTAATTGGAATGATGGT GAC-3′，下游引物：5′-ATGCCCCCAACCGTTCCTA TTA-3′。

3.3.3 PCR 反应的建立及产物鉴定 25 μL PCR反应体系组成：2×Taq PCR Master Mix12.5 μL，l0 mmoL/L 上、下游引物各1μL，模板DNA 2 μL，补水至25 μL。PCR 循环参数：94 ℃，预变性5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸l min，重复10 个循环，每个循环退火温度降0.5 ℃；然后94 ℃变性15 s，55 ℃退火30 s，72℃延伸l min，重复25 个循环；最后72 ℃延伸5 min。PCR 产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定。

检测结果：通过PCR 扩增，经琼脂凝胶电泳，扩增出大小约为339 bp 的DNA 片段，如图1。

图1 犬巴贝斯18S rR NA 基因PC R 扩增结果

3.3.4 序列测定及分析 将PCR产物送往上海生工生物工程技术服务有限公司测序。测序结果得到一条长度为294 bp 序列，将序列上传到NCBI 并获得登录号：KJ000098。经BLAST 软件在线比对分析，显示该序列与GenBank 中收录的Babesia canis vogeli（登录号为：KC989959.1）18S rRNA 基因序列同源相似性为100%。

4 讨论

根据临床发病症状可以初步诊断为犬细小病毒病，但是有时候很难与肠炎型犬瘟热、犬冠状病毒病及细菌性肠炎区别开。我们根据病犬临床症状，并且使用了CDV、CPV、CCV 抗原快速检测试纸来检测，结果显示CPV 阳性，CDV 与CCV阴性，确诊为犬细小病毒病[6]。

该犬生前可视黏膜苍白，血常规检查中红细胞数与红细胞积压降低，说明该病犬可能贫血，白细胞数增多表明该病犬可能有并发症，其中嗜酸性粒细胞明显增多，且体表发现蜱虫，因此我们怀疑该犬可能还感染了其他的血液寄生虫。为此，进行了犬的巴贝斯虫PCR 检测。引物参照翟晓虎[5]报道的犬吉氏巴贝斯虫和犬巴贝斯虫18S rRNA 基因通用引物，PCR 扩增、测序比对分析证实了犬韦氏巴贝斯虫的感染。

病犬在确诊为细小病毒感染后第2 天死亡，PCR 检测证实该犬还存在有犬巴贝斯虫感染。这种混合感染是否起到协同效应，加速了病犬的死亡还要做进一步的研究。但是我们的检测证实，细小病毒可以与犬巴贝斯虫发生混合感染，在疾病的诊治中，我们不能确诊感染了细小病毒后就忽略犬巴贝斯虫的存在。

[2] Nuttall G H F.On haematozoa occurring in wild animals in Africa[J].Parasitology，1910，3（1）：108-116.

[3] Carret C，Walas F，Carcy B，et al.Babesia canis canis，Babesia canis vogeli，Babesia canis rossi: differentiation of the three subspecies by a restriction fragment length polymorphism analysis on amplified small subunit ribosomal RNA genes[J].Journal of Eukaryotic Microbiology，1999，46（3）：298-301.

[4] 权中会，魏莉，赵献军，等.西安地区犬吉氏巴贝斯虫病的诊断与治疗[J].中国兽医杂志，2012，48（4）：64-65.

[5] 金兰梅，伍清林，董尹波，等.巴贝斯虫病在南京宠物犬中流行情况的调查[J].金陵科技学院学报，2005，21（4）：93-96.

[6] 翟晓虎，姚大伟，贺卫华.一例犬吉氏巴贝斯虫病的PCR 诊断[J].畜牧与兽医，2011，43（12）：80-81.

[7] 史利军，曾妮，李刚.犬细小病毒生物学特征及检测技术研究进展[J].动物医学进展，2010，31（4）：82-85.