张彦荣，王志波，毕伟，张文涛，吕璐

(1河北医科大学第二医院，石家庄050000;2河北医科大学基础医学院; 3中山大学中山医学院)

骨骼肌缺血再灌注损伤在临床上很常见，再灌注损伤不仅可以导致局部组织第二次打击，还能导致远隔器官(如肾、肺等)的继发性的损伤［1］。细胞间黏附分子1(ICAM-1)属免疫球蛋白超家族成员，介导中性粒细胞与血管内皮细胞黏附及中性粒细胞穿过血管壁的过程，是缺血再灌注损伤中的重要的炎性介质，可激活一氧化氮合酶(iNOS)产生大量的一氧化氮(NO)，造成组织损伤［2］。氨基胍(AG)是iNOS的抑制剂，研究表明，AG主要通过抑制iNOS的活性进而减少NO的产生而起作用［3］。2013年1～5月本实验采用AG进行治疗，通过观察ICAM-1、NO的变化及肺组织损伤情况，进一步探求AG在骨骼肌缺血再灌注肺损伤中作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性Wister大鼠24只，体质量200 g左右，由本校实验动物中心提供。AG购自Sigma公司，ICAM-1免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物公司，NO、乳酸脱氢酶(LDH)、髓过氧化物酶(mpo)，检测试剂盒购自碧云天生物工程有限公司，Trlzol RNA提取试剂Invitrogen公司产品;逆转录酶(M-MLV)、核糖核酸酶抑制剂、dNTP、Taq DNA聚合酶、随机引物及琼脂糖均为美国Promega公司产品;荧光定量试剂盒购自BBI公司。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组 将24只大鼠随机分为4组，每组6只，Ⅰ组为对照组，仅进行常规麻醉，不阻断后肢血流(10 h后取材);Ⅱ组为缺血组，即阻断后肢动脉致缺血4 h，不行再灌注;Ⅲ组为I/R组，即阻断后肢动脉致缺血4 h再灌注6 h;Ⅳ组为I/R+AG组，即阻断后肢动脉致缺血4 h再灌注6 h，再灌注开始时经尾静脉注射AG注射液(150 mg/kg)［4］。

1.2.2 模型制备方法 20%乌拉坦(5 mL/kg)腹腔注射麻醉，止血带捆扎两侧大腿根部，使两后肢缺血4 h后去除止血带实现再灌注［5］，各组设定时间处理动物，分别取材。

1.2.3 血清LDH、NO及肺组织MPO检测 各组大鼠实验结束时经心脏穿刺取血清，采用全自动生化分析仪检测血清LDH含量，用Bio Tek ELX800酶标仪严格按照NO检测试剂盒进行NO检测，取肺组织匀浆并用ELISA检测试剂盒检测肺组织中MPO含量。

1.2.4 肺组织ICAM-1蛋白表达检测 对4组肺组织进行免疫组化染色，肺泡上皮细胞胞质内出现淡黄色、棕黄色或棕褐色颗粒者为阳性细胞。ICAM-1阳性判断标准参考文献［6］。计数5个高倍视野，按照染色强度计分:0分为无着色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色;按阳性细胞所占百分比计分:无阳性细胞计0分，≤10%计1分，11%～50%计2分，51%～75%计3分，＞76%计4分;二者计分相乘0～2分为(－)，≥3分为(+)。

1.2.5 肺组织ICAM-1基因表达检测 采用RTPCR法检测 4组肺组织 ICAM-1基因的相对表达量。

1.2.6 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。实验数据以s表示，多组间比较进行单因素方差分析，进一步组间比较采用t检验。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血清LDH、NO及肺组织MPO比较 见表1。

表1 各组大鼠血清LDH、NO及肺组织MDO比较(s)

表1 各组大鼠血清LDH、NO及肺组织MDO比较(s)

注:与Ⅰ组比较，*P＜0.05;与Ⅲ组比较，△P＜0.05。

Ⅰ组＊△

2.2 各组肺组织ICAM-1蛋白表达比较 Ⅰ组肺泡上皮细胞未见阳性表达;Ⅱ组肺泡上皮细胞呈淡黄色颗粒状;Ⅲ组肺泡上皮细胞见棕褐色颗粒，呈强阳性表达;Ⅳ组阳性产物表达明显减轻。见插页Ⅲ图7。

2.3 各组ICAM-1基因在肺组织中相对表达量比较 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组ICAM-1基因相对表达量分别为0.75±0.18、4.0±0.56、13.6±1.56和6.99± 1.59。Ⅰ组ICAM-1表达不明显，在Ⅱ、Ⅲ组呈上升趋势，Ⅳ组表达下调，其余3组与I组比较，差异有统计学意义(P均＜0.05);Ⅳ组与Ⅲ组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。

3 讨论

目前认为，缺血再灌注导致肺损伤的机制之一为依赖中性粒细胞的途径［7］。ICAM-1介导白细胞与血管内皮细胞相互黏附，是白细胞聚集、活化和释放炎性介质的关键［8］。在组织缺血再灌注情况下，大量的过氧化物和超氧自由基产生，而自由基和NO是缺血再灌注损伤中的重要因素［9］，二者可激活NF-κB信号转导通路，NF-κB具有与某些基因启动子区的固定核苷酸序列结合而启动基因转录的功能，涉及各种信号机制的激活以及相应的细胞效应的产生［10］。造成包括ICAM-1在内的炎性介质的大量表达，使中性粒细胞与血管内皮细胞发生黏附，且穿越血管内皮细胞到达周围组织，产生炎症反应。中性粒细胞中存在MPO，每个细胞中所含的酶的量是一定的，MPO是中性粒细胞标志性的酶，因此，组织中MPO可反映中性粒细胞的浸润程度［11］。

本研究中，在缺血组及缺血再灌注组，肺组织MPO量及ICAM-1表达增强，说明缺血再灌注肺损伤时，中性粒细胞及炎性因子作用存在。iNOS是催化合成一氧化氮的酶，左旋精氨酸在iNOS的催化下合成NO，它与活性氧自由基反应生成具有细胞毒性的超氧亚硝酸离子(ONOOˉ)，对组织器官造成损害。AG是iNOS的抑制剂，可使iNOS活性降低，进而减少NO等氧自由基的产生［12］。本研究发现，AG治疗组不但血清中NO量下降，而且ICAM-1的表达及相对表达量均下降，因此可以推断，骨骼肌缺血再灌注肺损伤时AG可能通过减少氧自由基的产生，部分地阻止了炎症反应的发生，打断了炎症介质的级联反应，使ICAM-1的表达下降，从而减轻了肺脏的缺血再灌注损伤。

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