李永进 汤玉喜 唐洁 吴敏 杨艳

(湖南省林业科学院，长沙，410004)

转基因库安托杨对根际土壤微生物及酶活性的影响1)

李永进 汤玉喜 唐洁 吴敏 杨艳

(湖南省林业科学院，长沙，410004)

对4年生转基因库安托杨在生长过程中的土壤微生物和酶活性变化情况进行调查，发现转基因与非转基因株系的3大类根际微生物数量和蛋白酶活性分别表现为“增→减→增→减”和“减→增→减”的倒“S”型变化趋势，土壤脲酶、磷酸酶酶活性的变化趋势均呈“增→减”的倒“V”字型的变化趋势，且转基因库安托杨基本未对微生物数量和酶活性产生显著影响。

转基因库安托杨；根际土壤；土壤微生物；土壤酶活性

From the changes of soil microorganisms and enzyme activity caused by the growth of four-year transgenicPopulus×euramericana‘Guariento’, the number of microorganisms and proteinase activities showed “M” slope and lain letter S slope, respectively. But the change trend of soil urease and phosphotase activities showed lain letter V slope, and transgenicPopulus×euramericana‘Guariento’ had no significant effect on the number of microorganisms and proteinase activities (P>0.05).

20世纪90年代以来，转基因生物的安全性受到学术界和整个社会的高度重视，转基因植物对非目标生物和生态系统的影响成为一个研究热点[1-5]。转基因植物外源基因通过根系的分泌物、植物残体和根系脱落物进入土壤中，一旦影响到土壤微生物的组成、区系和酶活性，就有可能影响整个土壤生态系统的功能和农业生态系统的健康稳定，因此转基因植物对土壤生态系统的影响进行研究是生态系统安全评价的重要方面。

杨树是世界上中纬度地区广泛栽培的重要用材树种，同时也是林木基因工程领域的模式树种。以往杨树转基因多是利用单个目的基因改良林木的个别性状,利用转基因技术将多种基因转入杨树改良其复杂性状相对较少[6-9]。2006年王建革等[10]利用基因枪法同时将5个外源基因成功转入库安托杨(Populus×euramericana‘Guariento’)并将成活植株进行田间耐涝生理试验[11-12]。但转基因库安托杨是否会对土壤生态系统产生影响研究较少，有关洞庭湖区的转基因库安托杨对根际土壤微生物及酶活性的研究更未见报道。因此，我们对洞庭湖区转基因库安托杨对根际土壤微生物、酶活性进行了研究，以期为转基因杨树的推广应用提供参考，并为进一步深入研究奠定基础。

1 试验地概况

试验地位于岳阳市君山区(28°59′～29°38′N，112°43′～113°15′E)，属中亚热带向北亚热带过渡气候区，具有湿润的大陆亚热带季风气候，年平均气温17 ℃,极端高温39.3 ℃,极端低温-11.8 ℃,年平均降水量1 237.9 mm,年均相对湿度80%。土壤为湖潮土，土质肥沃，透水性较高。

2 材料与方法

2.1 供试材料

2009年以中国林业科学院提供的22个转基因库安托杨系号为材料，在岳阳市君山区上反嘴村进行环境释放试验，试验林面积约0.25 hm2，造林密度为3 m×4 m。本研究选取转基因库安托杨其中的4个株系(D5-4、D5-9、D5-21、D5-25)及一个非转基因对照株系(D5-0)，这4个株系含有不同数量的外源基因，其目的基因数量和种类已经过测定。转基因库安托杨所转化的5个外源基因包括透明颤菌血红蛋白基因(vgb)、果聚糖蔗糖转移酶基因(SacB)、BtCry3A基因、OC-1基因、JERF36基因。

2.2 土样采集

于2012年5—11月的中旬用抖根法采集试验林地内4个转基因株系和1个非转基因株系0～50 cm的根际土壤，取样采取随机取样法，每个株系每次重复4次，将土样装入灭菌布袋中混合均匀。土样采集后放入冰箱中4 ℃保存。

2.3 测定指标与方法

土壤全氮测定采用凯氏定氮法、全磷测定采用氢氧化钠碱熔—钼锑抗比法、全钾测定采用氢氧化钠碱熔—火焰光度法、有机质测定采用重络酸钾—外加热法(GB7854—87)、土壤pH值采用pH计测定[13]。土壤微生物测定采用稀释平板法：细菌用牛肉膏蛋白胨培养基，真菌用马丁氏培养基,放线菌用改良高氏I号培养。土壤脲酶活性采用次氯酸钠比色法测定、土壤磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法测定，土壤蛋白酶采用茚三酮比色法测定[14]。脲酶活性以24 h后1 g土壤中NH3-N的质量表示；磷酸酶活性测定采用磷酸苯二钠比色法，以24 h后1 g土壤中酚的质量表示；蛋白酶活性以24 h后1 g土壤中氨基氮的质量表示。

2.4 数据处理

采用SPSS10.0、Excel等软件进行数据处理与分析。

3 结果与分析

3.1 试验林土壤理化性质

在试验林内随机选取8个样点采集0～50 cm土样，然后进行理化性质的测定(表1)。发现8个土样的理化性质的标准偏差值较小，证明试验林土壤本底基本一致。

表1 试验林土壤中各物质质量分数比较

3.2 转多基因库安托杨试验林中微生物数量的变化

土壤中的微生物以细菌为主，占总数的90%以上，真菌最少(表2)。在同一月份，4个转基因库安托杨株系0～50 cm根际土壤中仅D5-25株系的细菌、放线菌和真菌的数量略高于对照，其他转基因株系与非转基因株系细菌、放线菌和真菌的数量基本相同；转基因株系间、转基因株系与对照间根际土壤中的细菌、放线菌和真菌数量均无显著差异(P>0.05)，这与周晓罡，赵蓬晖等[15-17]的研究结果相一致。在5—11月份的调查期内，转基因与非转基因株系的细菌、放线菌和真菌数量大致均呈“增→减→增→减”的变化趋势，其中5月初由于土壤温度和水分含量低，微生物处于相对封闭的环境，养分无法通过水分扩散，导致0～50 cm根际土层内3大类微生物的平均数量都低[18-20]；6—9月份是降雨高峰期，也是高温期，土壤水分充足，利于养分的溶解，易于微生物吸收而使微生物快速繁殖；而10月份地表枯落物增加，可为微生物提供较多养分和能量，使得微生物总数仍处于较高水平；11月份细菌、放线菌和真菌的数量均有下降的趋势。总体上看，根际土壤中细菌、真菌、放线菌的数量整体呈现随降雨、温度、湿度变化增加而递增的趋势[21]，且与非转基因库安托杨相比，转基因库安托杨没有对细菌、放线菌和真菌产生显著影响。但由于试验林土壤生态系统组成、结构、功能复杂，相关机理还有待于做深入的研究和探讨。

3.3 转基因库安托杨对土壤酶活性的影响

同一月份转基因株系与对照株系0～50 cm土壤脲酶、磷酸酶和蛋白酶活性差异不显著(表3)。3种酶活性随季节的变化表现基本一致。其中，土壤脲酶、磷酸酶活性在5月份为最低值，分别介于0.09～0.13和2.86～3.22 mg/(g·d)之间，此后随着进入杨树生长旺期，转基因杨与对照杨土壤内的土壤脲酶活性均迅速上升且变化规律一致，均在9月份达到最高值，分别介于0.37～0.46和5.98～6.52 mg/(g·d)之间，之后随着气温的降低开始下降，在整个调查期内，5个株系0～50 cm根际土壤中的脲酶、磷酸酶活性大致呈“增→减”的倒“V”字型变化趋势；而蛋白酶活性6月份最低，变化范围为1.6～1.8 mg/(kg·d)，而10月份蛋白酶活性最高，介于4.91～5.25 mg/(kg·d)，之后随着气候的降低蛋白酶活性逐渐下降。在5—11月份调查期间，转基因库安托杨与对照0～50 cm土壤蛋白酶活性均呈减→增→减的倒“S”型变化趋势。5—11月的土壤脲酶(8月份除外)、磷酸酶、蛋白酶活性与对照均无显著差异(P>0.05)。表明调查期内转基因杨对土壤脲酶、磷酸酶、蛋白酶活性影响不明显，但是长期种植转基因库安托杨是否会造成影响，还需要进一步研究。

表2 转基因株系土壤根际微生物数量季节动态变化

月份放线菌/106个·g-1D5-4D5-9D5-21D5-25D5-05月18.16±1.7815.16±1.6614.15±0.5414.56±3.0514.57±0.296月18.16±3.0118.00±3.3719.75±1.9523.39±2.0922.26±2.517月18.16±4.1837.43±6.2223.95±5.1925.44±7.0133.32±4.868月18.16±3.5322.23±3.7122.03±1.1420.07±1.2119.88±1.099月18.16±3.2433.77±2.8736.45±3.7635.62±4.0139.97±2.7810月18.16±2.7320.98±4.3224.96±1.9926.14±2.2321.85±1.3111月18.16±2.1513.79±3.0912.34±2.1217.38±3.2217.98±1.76

月份细菌/107个·g-1D5-4D5-9D5-21D5-25D5-05月18.16±0.100.49±0.230.38±0.170.31±0.090.58±0.186月18.16±0.523.10±0.413.60±0.363.92±0.694.62±0.677月18.16±0.252.80±0.473.05±0.312.82±0.373.24±0.308月18.16±0.563.47±0.494.32±0.614.86±0.714.38±0.519月18.16±0.672.27±0.713.07±0.574.25±0.922.63±0.6610月18.16±0.301.93±0.212.55±0.282.75±0.422.69±0.4111月18.16±0.100.37±0.140.19±0.890.11±0.160.37±0.18

注：表中数据为平均值±标准差。

4 结论与讨论

一直以来，转基因植物对土壤生态系统可能造成的影响一直是人们进行转基因植物安全性评价的焦点。研究者们在转基因林木对土壤微生物数量、酶活性的影响方面存在不同意见[22-26]。有些学者认为由于植物残体及根际分泌物带给土壤的Bt毒蛋白需要一定的时间才能消解，可能对土壤微生物区系、酶活性产生影响，使根际土壤的磷酸酶活性、脱氢酶和碱性磷酸酶活性显著降低[27]。但大部分研究结果尚未发现转基因植物对土壤微生物、酶活性产生明显影响。如对转基因的棉花、转双价抗真菌基因水稻、转几丁质酶基因水稻等从生长繁殖到衰老过程中根际部位土壤中的土壤脲酶、过氧化氢酶、酸性磷酸酶、脱氢酶、多酚氧化酶和蛋白酶等酶的活性与对照相比均无显著差异；转基因小黑杨根际分泌物不会对土壤多酚氧化酶、脲酶及磷酸酶活性产生显著性影响等[28-29]。

本文将试验林内转基因植株与非转基因根际土壤中的细菌、放线菌和真菌3类微生物进行了比较，初步证明库安托杨转基因植株根际土壤3类微生物数量与非转基因植株之间虽在不同时期存在一定差异，但未达到统计学显著水平。这与胡建军等先后对转基因欧洲黑杨、转基因银腺杨(P.alba×P.glandulosa)和转抗虫基因(BtCry3A)741杨试验林土壤微生物进行研究发现其根际土壤微生物区系未发生明显的变化相一致[30-31]。

表3 转基因株系土壤酶活性季节动态变化 mg·g-1·d-1

月份磷酸酶D5-4D5-9D5-21D5-25D5-05月3.22±0.143.20±0.043.11±0.112.86±0.112.93±0.116月3.71±0.124.00±0.174.03±0.093.78±0.173.93±0.197月4.28±0.184.60±0.214.21±0.244.12±0.224.36±0.228月4.54±0.194.71±0.354.45±0.314.94±0.314.91±0.329月5.98±0.196.42±0.496.29±0.396.16±0.286.52±0.2710月4.60±0.384.19±0.274.11±0.423.51±0.464.51±0.3311月2.89±0.423.61±0.184.02±0.393.03±0.533.17±0.38

月份蛋白酶D5-4D5-9D5-21D5-25D5-05月2.09±0.121.92±0.221.81±0.191.90±0.202.14±0.116月1.65±0.071.8±0.161.60±0.091.75±0.121.76±0.107月1.97±0.071.93±0.031.80±0.051.84±0.091.99±0.098月1.83±0.152.14±0.052.21±0.182.06±0.162.24±0.229月3.71±0.193.14±0.253.30±0.093.35±0.173.40±0.3110月4.91±0.135.01±0.095.25±0.114.93±0.235.11±0.2311月4.05±0.194.28±0.174.54±0.214.44±0.404.58±0.31

注：表中数据为平均值±标准差；8月份土壤脲酶与对照比差异显著(P<0.05)。

土壤酶在土壤有机物分解和营养元素循环过程中起到不可或缺的作用，影响土壤生态系统中的能量转化、土壤微生态的环境质量和作物产量。本文研究结果表明，转基因库安托杨试验林土壤脲酶、磷酸酶和蛋白酶活性与非转基因库安托杨之间同一月份不存在显著性差异，且3种土壤酶活性存在明显的季节性变化。但引起土壤微生态的波动的因素较多，此仅为1 a的调查数据，因此，需要继续进行长时间的跟踪调查研究，获得较全面的转基因树木安全性的基础数据，以评估其大面积释放的安全性。

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Effect of TransgenicPopulus×euramericana‘Guariento’ on the Microorganism and the Enzyme Activity in the Rhizosphere Soil

Li Yongjin, Tang Yuxi, Tang Jie, Wu Min, Yang Yan(Hunan Academy of Forestry, Changsha 410004, P. R. China)/Journal of Northeast Forestry University，2015,43(2)：55-58.

TransgenicPopulus×euramericana‘Guariento’; Rhizosphere soil; Soil microorganisms; Soil enzyme activity

1) 湖南省自然科学基金项目(12JJ3031)；国家林业局科技发展中心项目(JJ-11-01)。

李永进，男，1980年 9 月生，湖南省林业科学院，助理研究员。 E-mail：youngon@126.com。

2014年9月23日。

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责任编辑：潘 华。