张鑫，吴剑平，严凤，陆淳，顾欣

(上海市动物疫病预防控制中心，上海201103)



基于双柱固相萃取-色质联用技术同时检测鸡肉中8种抗病毒药物残留

张鑫，吴剑平，严凤，陆淳，顾欣*

(上海市动物疫病预防控制中心，上海201103)

建立了双柱固相萃取-液相色谱-串联质谱法，可实现对鸡肉中金刚烷胺、金刚乙胺、美金刚胺、吗啉胍、利巴韦林、阿昔洛韦、更昔洛韦、奥司他韦等8种抗病毒药物的同时分析。采用三氯乙酸水溶液-乙腈对鸡肉中8种抗病毒药物残留同时提取，依次通过石墨化碳柱和强阳离子交换柱以实现对目标药物的富集、净化，选用石墨化碳色谱柱进行分离，超高效液相色谱-串联质谱检测。本文通过研究不同提取溶液、固相萃取柱及色谱柱对检测结果的影响，最终建立优化的检测方法,采用外标法计算，检测限1 μg/kg，定量限2 μg/kg，添加浓度在2～200 μg/kg范围内的回收率大于80%，适用于鸡肉中8种抗病毒药物的同时分析。

石墨化碳；抗病毒药物；残留检测

在我国金刚烷类、核苷类、杂环双胍类以及神经氨酸酶抑制剂的抗病毒药物都曾被报道用于兽医临床治疗病毒感染[1]，近年来，为预防禽流感，抗病毒药物在畜禽养殖环节有滥用现象，2012年的“速成鸡”事件中检出鸡肉中残留有金刚烷胺和利巴韦林，给我国家禽业带来了严重的负面影响。抗病毒药物在畜禽养殖业的非法使用屡禁不止，同时国内外对动物组织中的抗病毒药物多残留的检测方法研究较少，给此类药物的监管带来了不便。抗病毒药物的作用机理和理化性质各异，传统前处理方法具有一定选择性，且动物组织中药物残留量低，经过复杂的提取净化去脂步骤后，回收率不高，目前的文献报道[2-4]检测鸡肉中的抗病毒药物残留的方法多局限与某一类抗病毒药物，或采用通用的QuEChERS法进行前处理，杂质去除不够充分，本文建立的双柱固相萃取法是利用固相萃取柱对药物的不同选择性，将药物分别保留在石墨化碳柱和强阳离子交换柱上，并通过洗脱液置换，将8种药物浓缩在同一溶剂中，进而实现了在液质联用仪上的同时分析，与目前有文献[4-6]报道的方法相比，可同时检测的药物种类更多，操作简便，检测限更低，实用性和创新性较强。本研究建立的同时检测鸡肉中8种抗病毒药物残留量的检测方法，对于有效监控该类药物的使用、保障我国动物性食品安全具有重要的意义。

1 材料和方法

1.1 仪器与试剂 Waters TQ Xevo串联四极杆质谱(ESI+)、强阳离子交换固相萃取柱(Waters MCX 3mL/60mg)、石墨化碳固相萃取柱(Thermo Hyper Carb 3mL/200 mg)、石墨化碳色谱柱(Thermo Hyper Carb 100 mm×2.1 mm，5 μm)；高速冷冻离心机(Allegra X-22R，美国Beckman Coulter)；水浴控温氮吹仪(N-EVAP，上海安谱公司)。金刚烷胺(Amantadine，ATD)，金刚乙胺(Rimantadine，RTD)，美金刚胺(Memantine，MMT)，吗啉胍(Moroxydine，MXD)，利巴韦林(Ribavirin，RBV)，阿昔洛韦(Acyclovir，ACLV)，更昔洛韦(Ganciclovir，GCLV)，奥司他韦(Oseltamivir，OSTV)(纯度均≥99.0 %，德国Dr.Ehrenstofer GmbH)；乙腈、甲醇、甲酸(色谱纯，德国Merk)；去离子水(自制，电阻率≥18 MΩ·cm)；高纯氮、高纯氩(纯度均为99.999%，上海佳杰特种气体公司)。

1.2 方法

1.2.1 液相色谱方法 色谱柱：ThermoHyperCarb(100 mm×2.1 mm，5 μm)，柱温35 ℃，流速0.2 mL/min,进样量10 μL，流动相：A为乙腈，B为0.005 mol/L乙酸铵，采用梯度洗脱程序: 10%A起始保持1 min，2 min时变化至40%A，保持2 min，6 min时变化至10%A，保持2 min。

1.2.2 质谱方法 质谱条件为：选择正离子模式，电离模式：正离子扫描；检测方式：多反应监测(MRM)；离子源温度150 ℃；毛细管电压3.0 kV；脱溶剂温度500 ℃；，碰撞气压力0.24 Pa，定性与定量离子对以及对应的撞击能量见表1。

1.2.3 前处理方法 取5 g鸡肌肉置于离心管中，加2%三氯乙酸水溶液/乙腈(80:20)10 mL提取，Ika匀浆机匀浆1 min，震荡提取15 min，10000 r/min离心5 min，取上清液依次通过HyperCarb柱(乙腈、甲醇各3 mL活化)和MCX柱(甲醇、水各3 mL活化)，0.2%甲酸水溶液/乙腈(60:40)1 mL洗脱HyperCarb柱,用试管收集洗脱液,备用，MCX柱依次用水、甲醇各3 mL洗涤，氨水甲醇3 mL洗脱，用试管收集洗脱液，N2吹干，残渣用备用液溶解，上机。

2 结果与分析

2.1 检测限、定量限和回收率 在空白鸡肉中添加标准工作溶液，使其含量分别为2.0、10.0、50.0、200.0 μg/kg，每个浓度平行添加3份，重复3批次，按1.2.3项方法处理后测定，结果表明在2.0～200.0 ng/g内回收率良好。以信噪比S/N≥3确定方法的检出限( LOD) 为1.0 μg/kg，以S/N≥10 确定方法的定量限( LOQ) 为2.0 μg/kg(表2、图1)。

表1 抗病毒类药物标准品及其内标质谱参数

* 定量离子对

表2 空白鸡肉中添加8种药物的添加回收率及批内批间差异

续表

图1 空白鸡肉中8种抗病毒药物MRM谱图的信噪比(2 μg/kg)

2.2 前处理方法的选择 为了研究不同前处理方法对药物的选择性，比较了直接提取法、分散固相萃取法以及固相萃取柱法。结果显示，使用酸性水溶液或酸性乙腈直接提取可以提取出所有药物，但稀释倍数较大，酸性乙腈提取后可氮吹浓缩，浓缩倍数增加的同时，基质干扰也较大；分散固相萃取法在酸性乙腈直接提取的基础上加入C18粉和PSA会导致药物回收率有一定降低；固相萃取柱法在提纯和浓缩方面均有较好效果，但8种药物的性质差异较大，因此选用单一固相萃取柱无法将全部药物都保留，需考虑串接固相萃取柱来实现对鸡肉中所有抗病毒药物的富集和净化，尝试采用混合阳离子交换柱(MCX)和石墨化碳固相萃取柱(Hypercarb)进行串接，取得了较好的效果。

为保证药物可同时被提取出来，又能够在两种小柱上实现分离和保留，还需要探讨药物的性质、提取液的选择、固相萃取小柱的选择性以及色谱柱的匹配度等问题。

2.3 药物性质及提取液的选择 表3给出了8种药物理化特性的理论值，包括水溶解系数(LogS)、水油分配系数(LogP)、解离系数(pKa)等。8种药物属于不同类别的抗病毒药物，溶解性质和酸碱性质差异较大，单用水相或有机相都不能实现完全提取，因此尝试了甲酸水-乙腈、水-乙腈、乙酸铵-乙腈和三氯乙酸水溶液-乙腈4种提取液，结果显示，2%三氯乙酸水溶液-乙腈(80/20)效果最好，一方面，可以提取全部药物并起到沉淀蛋白的作用，另一方面，石墨化碳固相萃取柱能够对对水相较多的体系进行保留和净化，而混合阳离子交换柱要求较低pH值，2%三氯乙酸水溶液-乙腈(80/20)同时满足了上述全部条件。

表3 8种抗病毒药物的溶解度参数及解离系数

2.4 固相萃取柱选择性考察 研究了反相固相萃取柱(HLB)、混合阳离子交换柱(MCX)、石墨化碳固相萃取柱(Hypercarb)等对阳性添加样品(2 μg/kg)的检测结果。HLB回收率很低，不适合抗病毒药物的分析，MCX和Hypercarb分别可实现对部分药物的富集净化，分析可能存在无保留或难以用同一种溶剂洗脱下来的情况，有文献曾报道类似情况[8]，将两者串联使用，可最大程度的发挥两者的作用，获得所有药物的较高回收率。试验中发现，Hypercarb能够保留的药物更多且作用力较弱，易于被洗脱，因此，先通过Hypercarb，使药物优先保留在Hypercarb上，可防止药物在MCX柱上产生较强的键合作用而影响回收率(表4)。

表4 鸡肉中8种抗病毒药物采用不同固相萃取柱净化后的检测结果

ND未出峰，○回收率<60%，√回收率≥60%，△回收率≥80%

2.5 色谱柱适用性考察 采用不同的色谱柱和流动相体系，会影响药物的保留时间、出峰顺序、响应值等，本文比较了四种色谱体系：亲水色谱柱(HILIC)、反相色谱柱(HSS T3)、正相色谱柱(BEH Amide)、石墨化碳色谱柱(Hypercarb)，不同前处理方法在4种色谱体系中的分析结果见表5。

鸡肉中8种药物经QuEChERS法和Hypercarb-MCX法处理后在4种色谱体系中均有出峰，但QuEChERS法杂质干扰明显，峰型不佳，Hypercarb-MCX法的净化效果有明显改善；在反相柱体系中，利巴韦林和阿昔洛韦保留不佳，在1.2 min出峰，易受杂质峰干扰；在亲水色谱柱和正相色谱柱体系中金刚烷胺，金刚乙胺，美金刚胺，吗啉胍，奥司他韦均在1.5～1.8 min出峰，易受杂质峰干扰；在石墨化碳色谱柱体系中获得了较满意结果(图2)。

表5 前处理方法与4种不同色谱体系匹配度的考察

图2 阳性添加样品双柱法-石墨化碳柱色谱体系下的TIC图(2 μg/kg)

3 小结

本文建立的双柱固相萃取-串联质谱法将鸡肉中8种药物通过串接的固相萃取柱进行充分的富集净化，最终浓缩在1mL溶剂中，净化效果更好，进而采用对抗病毒药物保留极佳的石墨化碳色谱柱进行分离，减少了药物在串联质谱上的基质效应和杂质干扰，可使最低检测浓度降低至1 μg/kg，较文献方法更灵敏，准确度更高，适合鸡肉中多种抗病毒药物残留的定性定量检测。

[1] 孙雷,李丹,毕言锋,等.抗病毒药物的毒性及残留检测方法研究进展[J]. 中国兽药杂志,2013,10:57-61.

[2] 尹晖,孙雷,毕言锋,等. 鸡肉和鸡蛋中金刚烷胺与金刚乙胺残留检测UPLC-MS/MS法研究[J]. 中国兽药杂志,2014,48(6):32-35.

[3] 魏秀丽,高迎春,陈玲,等. 超高效液相-串联质谱法测定鸡肉组织中金刚烷胺残留[J]. 中国兽药杂志,2013,47(6):53-55.

[4] 曲斌,朱志谦,陆桂萍,等. UPLC-MS/MS快速测定鸡肉中金刚烷胺和氟喹诺酮类药物残留[J]. 中国兽药杂志,2013,47(7):50-54.

[5] 艾连峰,马育松,陈瑞春,等.在线净化液相色谱串联质谱法测定动物源食品中金刚烷胺的残留[J]. 分析化学,2013,8:1194-1198.

[6] 云环,崔凤云,严华,等.超高效液相色谱-串联质谱法测定鸡肉中的利巴韦林和金刚烷胺[J]. 色谱,2013,8:724-728.

[7] 祝伟霞,杨冀州,袁萍,等.超高效亲水色谱-串联质谱法快速检测鸡肉及其制品中的利巴韦林及其代谢物的总残留量[J]. 色谱,2013,10:934-938.

[8] 刘正才,杨方,余孔捷,等.液相色谱-电喷雾串联质谱法同时检测鸡组织中5种抗病毒类药物的残留量[J]. 色谱,2012,12:1253-1259.

[9] Bjorn J. A. Berendsen,Robin S. Wegh,Martien L. Essers,etal. Quantitative trace analysis of a broad range of antiviral drugs in poultry muscle using column-switch liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry,2012,402(4):1611-1623.

(编辑：侯向辉)

Simultaneous Analysis of Eight Antiviral Drug Residues in Chicken Based on a Double-column Designed Solid Phase Extraction Combined with LC-MS/MS Method

ZHANG Xin, WU Jian-ping, YAN Feng, LU Chun, GU Xin*

(ShanghaiAnimalDiseaseControlCenter，Shanghai201103，China)

A novel detection method based on a double-column designed solid phase extraction(SPE)combined with LC-MS/MS was developed for the simultaneous analysis of eight antiviral drugs residues in chicken, including amantadine, rimantadine, memantine, moroxydine, ribavirin, acyclovir, ganciclovir and oseltamivir. A graphitic carbon column and a strong cation exchange column were connected and used in series to enrich and purify the analytes from the trichloroacetic acid-acetonitrile aqueous solution.The eight drugs were separated by Hypercarb column and detected by LC-MS/MS method.The influences of the used dilutionsolvent, solid phase extractioncolumns andchromatographic columns on the test results were investigated to optimize the detection method. The results showed a low limit of detection down to 1 μg/kg. And the limit of quantization of 2 μg/kg was achieved. Moreover, the fortified concentrations could range from 2 to 200 μg/kg, and the recovery was higher than 80%. Hence, the detection method presented would be a promising candidate if the quick analysis for multicomponent and complicated samples was needed.

graphitic carbon; antiviral drug; residue detection

上海市市级农口系统青年人才成长计划：沪农青字(2014)第2-5号；公益性行业(农业)科研专项(201203023)

张鑫，硕士，畜牧师，从事兽药残留分析研究。

顾欣。E-mail：guxun@sh163.net

2015-08-03

A

1002-1280 (2015) 09-0045-06

S859.84