许嵘　朱加明　龚劭敏　卢泽军　张慧　刘少鹏　丁小强　钟一红

(1. 南京中医药大学附属医院江苏省中医院肾内科，江苏南京　210029；

2. 复旦大学附属中山医院肾内科，上海　200032)



·论著·

双向凝胶电泳联合MALDI-TOF/TOF MS技术探寻狼疮性肾炎的血清标志物

许嵘1朱加明2龚劭敏2卢泽军2张慧2刘少鹏2丁小强2钟一红2

(1. 南京中医药大学附属医院江苏省中医院肾内科，江苏南京210029；

2. 复旦大学附属中山医院肾内科，上海200032)

摘要目的：通过双向凝胶电泳与基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF MS)技术初步探寻狼疮性肾炎(LN)患者潜在的血清分子标志物，为阐明LN的发病机制奠定基础。方法： 将40例LN患者分为活动组和缓解组，每组20例；另选择IgA肾病患者和健康志愿者各20例，分别作为IgAN组和健康对照组。采用双向凝胶电泳技术分离血清蛋白质，并采用MALDI-TOF/TOF MS鉴定差异表达的蛋白质。结果：共发现50个差异表达蛋白质。与健康对照组相比，LN活动组和LN缓解组共发现23个差异表达的蛋白质，上调8个、下调15个；与IgAN组相比，LN活动组和LN缓解组共发现18个差异表达的蛋白质，上调13个，下调5个；与LN缓解组相比，LN活动组表达上调和下调的蛋白质分别为4个和5个。在鉴定出的50个差异表达蛋白中，血清淀粉样蛋白A(SAA)在LN活动组中的表达高于其他组，complement component C4A在LN活动组中的表达低于其他组；chain B(solution structure of double super helix model)在LN缓解组的表达高于其他组；与健康对照组相比，vitamin D-binding protein isoform 1 precursor、chain A(crystal structure of uncomplexed vitamin D-binding protein)和chain B(a covalent dimer of transthyretin that affects the amyloid Pathway)等在LN活动组和LN缓解组的表达均上调，而vitronectin precursor、ficolin-2 isoform a precursor和chain A(crystal structure of the catalytic domain of human complement C1s protease)则相反；与IgAN组相比，lipoprotein CIII 和vitronectin precursor在LN活动组和LN缓解组的表达均上调。结论：双向凝胶电泳与MALDI-TOF/TOF MS联用技术有效实现了对LN患者血清差异表达蛋白质的筛选与鉴定。这些差异表达的蛋白质可作为生物标志物用于LN的无创性诊断和评估，对这些蛋白质的进一步研究将有助于更好地了解LN的发病机制。

关键词系统性红斑狼疮；狼疮性肾炎；蛋白质组学；质谱；生物标志物

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)是一种以免疫调节异常为特征、病变累及全身多系统多脏器的自身免疫性疾病。SLE的临床表现复杂多样。现有的实验室检测指标，无论是特异性还是敏感性，都难以满足临床早期诊断和病情评估的需要。绝大多数SLE患者有不同程度的肾脏病变，其中狼疮性肾炎(lupus nephritis, LN)是SLE最严重的并发症之一。肾活检是诊断和评估LN的可靠手段，但为有创检查，在临床广泛开展受到一定限制。因此，寻找早期诊断和评估LN的无创性方法十分必要。蛋白质组学是后基因组时代生物学研究的新方向。Zhang 等[1]应用蛋白质组学方法，从LN患者的尿液标本中找到了一些可以预测疾病复发的标志物。胡成效等[2]应用该技术获得了SLE患者外周血单个核细胞的蛋白质组差异表达图谱。本研究联合应用双向凝胶电泳与基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF MS)技术探寻LN无创性诊断和评估的潜在分子标志物，现报告如下。

1资料和方法

1.1一般资料本研究病例来自2011年6月—2012年2月在复旦大学附属中山医院肾内科就诊的患者。依据美国风湿病学会(American College of Rheumatology，ACR)SLE诊断标准[3]和肾活检病理检查确诊LN。将入组的40例LN患者按SLE疾病活动指数(systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI)[4]分为LN活动组(SLEDAI>9)和LN缓解组 (SLEDAI<5)，每组20例。LN活动组中，男性4例，女性16例，年龄18~69(39.75±14.20)岁；LN缓解组中，男性4例，女性16例，年龄14~65(31.25±13.92)岁。两组患者性别构成和年龄差异无统计学意义(P>0.05)。另选择性别、年龄相匹配的IgA肾病(IgA nephropathy, IgAN)患者和健康志愿者各20例，分别作为IgAN组和健康对照组。根据临床表现和肾活检诊断IgAN。IgAN组病理分级为Lee II~III级，尿蛋白定量1~3 g/24 h，肾功能正常，不伴恶性高血压。

1.2试剂与设备丙烯酰胺、双丙烯酰胺、N,N,N,’N’-四甲基乙烯胺(TEMED)、考马斯亮蓝R-250、琼脂糖、Tris、二硫苏糖醇(DTT)、苯甲磺酰氟(PMSF)、3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸(CHAPS)、十二烷基硫酸钠(SDS)、尿素、溴酚兰购自美国Amresco公司；乙腈(ACN，高效液相色谱纯化)购自德国Merck公司；三氟乙酸(TFA，高效液相色谱纯化)、碘乙酰胺(IAA)、碳酸氢铵(NH4HCO3)、α-氰基-4-羟基肉桂酸(α-CHCA)、胰蛋白酶、马心肌红蛋白购自美国Sigma公司；ProteoMiner高丰度蛋白质去除蛋白质浓缩试剂盒、固相pH 梯度胶条(pH 3~10 NL，18 cm )、两性电解质 (Bio-Lyte)、等电聚焦仪、GS-800分子成像仪、PDQuest 图像分析软件均购自美国Bio-Rad公司；5800串联飞行时间质谱仪(MALDI-TOF/TOF) 购自美国ABI公司。

1.3方法

1.3.1血清高丰度蛋白质的去除每例研究对象静脉采血5 mL，分离血清。 同组血清混合后，每组取1 mL混合血清，按照ProteoMiner试剂盒说明书的操作步骤去除血清中高丰度蛋白质，经洗脱后用改进的Bradford法测定蛋白质浓度，分装并保存于-80℃。

1.3.2双向凝胶电泳按照美国Bio-Rad公司双向凝胶电泳手册和Gorg等方法进行操作，即第一向等电聚焦采用固相pH 梯度胶条(pH 3~10 NL，18 cm )，上样量为250 μg(340 μL)，电压48 kV；等电聚焦结束后，进行胶条平衡，随后转移至12%的非梯度胶上进行SDS-凝胶电泳分离。采用银染法进行染色分析。

1.3.3图像分析染色凝胶采用GS-800分子成像仪(美国Bio-Rad公司)扫描，获取的图像用PDQuest数据处理软件(version 8.0, 美国Bio-Rad公司)进行强度校准、蛋白质点检测、背景扣除、均一化和匹配等分析。蛋白质点的相对强度升高或降低3倍者被定义为差异表达蛋白质点，进行质谱鉴定。

1.3.4MALDI-TOF/TOF MS鉴定按胶内酶解方法进行蛋白质酶解，将完全干燥的提肽液重新溶解于α-CHCA溶液中，点样于不锈钢靶板，室温下自然干燥。采用5800串联飞行时间质谱仪进行分析，激光波长为337 nm，加速电压为20 kV，脉冲宽度3 ns，离子延迟提取20 ns，采用正离子模式自动获取数据。肽质量指纹谱(PMF)质量扫描范围为700~3200 Da，对强度最大的6个峰进行串级质谱分析；PMF谱图用马心肌红蛋白酶解肽段做外标校正。所得PMF及串级肽序列采用MASCOT 系统(英国Matrix Science公司)在NCBI数据库检索。

2结果

LN活动组与健康对照组的血清蛋白质表达差异见表1~5。

在50个差异表达的蛋白质中，某些蛋白质如血清淀粉样蛋白A(SAA)在LN活动组中的表达高于其他组，complement component C4A在LN活动组中的表达低于其他组(图1)；chain B(solution structure of double super helix model)在LN缓解组的表达高于其他组；与健康对照组相比，vitamin D-binding protein isoform 1 precursor、chain A(crystal structure of uncomplexed vitamin D-binding protein)和chain B(a covalent dimer of transthyretin that affects the amyloid pathway)等在LN活动组和LN缓解组均表达上调，而vitronectin precursor、ficolin-2 isoform a precursor和chain A(crystal structure of the catalytic domain of human complement C1s protease)则相反。与IgAN组相比，lipoprotein CIII 和vitronectin precursor在LN活动组和LN缓解组的表达均上调。见图2。

表1　LN活动组与健康对照组相比有显著表达差异的蛋白质

表2　LN缓解组与健康对照组相比有显著表达差异的蛋白质

表3　LN活动组与IgAN组相比有显著表达差异的蛋白质

表4　LN缓解组与IgAN组相比有显著表达差异的蛋白质

表5　LN活动组与缓解组相比有显著表达差异的蛋白质

图1　SAA胰蛋白酶解肽段一级质谱图

a： LN活动组；b： LN缓解组；c： 健康对照组；d： IgAN组

1： SAA; 2： vitamin D-binding protein isoform 1 precursor; 3： chain A: crystal structure of uncomplexed vitamin D-binding protein; 4: chain B, a covalent dimer of transthyretin that affects the amyloid pathway; 5: vitronectin precursor; 6: ficolin-2 isoform a precursor; 7: chain A, crystal structure of the catalytic domain of human complement C1s protease; 8: lipoprotein CIII; 9: vitronectin precursor; 10: chain B, solution structure of double super helix model apolipoprotein A-IV, Apo A-IV

图2各组血清蛋白的双向电泳图谱(硝酸银染色)

3讨论

SLE是一种慢性自身免疫性疾病，可累及多个系统，但以肾脏受累最为常见。LN是SLE最严重的并发症之一，临床表现不一，可为无症状性蛋白尿，也可为急进性新月体肾炎[5]。LN是一种反复发作和缓解交替的慢性病。肾活检病理检查是诊断LN和评估病情的“金标准”，但肾活检毕竟是有创伤性检查，有些患者因病情较重而不能耐受，故临床应用受到限制。寻找无创性检查指标，对指导LN的诊断和病情评估意义重大。MALDI-TOF/TOF MS是目前较常用的高通量蛋白质鉴定方法[6-7]，可快速获得高灵敏度的多肽质量指纹图和多肽序列信息，有较高的蛋白质鉴定成功率。

本研究共获得50个在不同组间差异表达的蛋白质。与健康对照组相比，LN活动组和缓解组出现差异表达的蛋白分别为12个和11个，其中vitamin D-binding protein isoform 1 precursor、chain A(crystal structure of uncomplexed vitamin D-bin-ding protein)和chain B(a covalent dimer of trans-thyretin that affects the amyloid pathway)等在LN活动组和LN缓解组都表达上调，而ficolin-2 isoform a precursor、chain A(crystal structure of the catalytic domain of human complement C1s protease)和vitronectin precursor则相反。这些蛋白质分子可能参与了LN的发病过程。与IgAN组相比，LN活动组和缓解组分别有5个和8个蛋白表达显著上调，2个和3个蛋白表达显著下调，其中lipoprotein CIII 和vitronectin precursor在LN活动组和LN缓解组的表达均上调，对这些蛋白做进一步研究不仅有助于LN和IgAN的鉴别诊断，还可能有助于阐明原发性肾小球肾炎和继发性肾小球肾炎发病机制的差异。与LN缓解组相比，LN活动组有4个蛋白表达显著上调，5个蛋白表达显著下调，这些蛋白可能参与了LN的复发或缓解。对其进行进一步验证分析，有望筛选出用于评估LN的活动程度和指导治疗的新指标。

SAA主要功能有：参与脂类代谢和转运、刺激促炎性细胞因子生成和趋化炎性细胞等。SAA在机体发生细菌或真菌感染、肿瘤、类风湿性关节炎和血管炎时可显著升高(100~1000 mg/L)，在发生病毒感染或SLE时常为轻度升高(10~100 mg/L)。我们的研究结果显示，LN活动组SAA的表达显著高于健康对照组、IgAN组和LN缓解组，说明SAA可能参与了LN的发病过程，因此可能成为LN病情活动度的评估指标。

本研究中，Apo A-IV在LN缓解组的表达显著高于LN活动组和IgAN组，说明Apo A-IV可能通过增加表达来加强其抗炎作用从而促进LN病情的缓解。

本研究利用MALDI-TOF/TOF MS对LN患者血清差异表达蛋白质进行鉴定，共获得50个在各组间差异表达的蛋白质。对这些蛋白质做进一步功能研究和临床验证，有可能为LN的诊断、治疗和病情评估提供新的线索和依据。

参考文献

[1]Zhang X, Jin M, Wu H, et al. Biomarkers of lupus nephritis determined by serial urine proteomics[J]. Kidney Int, 2008,74(6):799-807.

[2]胡成效,戴勇,刘建军,等.系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞蛋白质组学研究[J].中华风湿病学杂志,2009,13(11)：779-782.

[3]Tan EM, Cohen AS, Fries JF, et al. The 1982 revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus[J]. Arthritis Rheum, 1982, 25(11):1271-1277.

[4]Gladman DD, Ibanez D, Urowitz MB. Systemic lupus erythematosus disease activity index 2000[J]. J Rheumatol, 2002, 29(2):288-291.

[5]王鸿利. 实验诊断学[M]．北京：人民卫生出版社，2006：325．

[6]Kim YR, Hikima J, Jang HB, et al. Identification and determination of antigenic proteins of Korean ranavirus-1 (KRV-1) using MALDI-TOF/TOF MS analysis[J]. Comp Immunol Microbiol Infect Dis, 2011, 34(3):237-245.

[7]Marsching C, Eckhardt M, Grone HJ, et al. Imaging of complex sulfatides SM3 and SB1a in mouse kidney using MALDI-TOF/TOF mass spectrometry[J]. Anal Bioanal Chem, 2011, 401(1):53-64.

Exploring Serum Protein Biomarkers of Lupus Nephritis by Using Two-Dimensional Gel Electrophoresis Combined with Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry

XURong1ZHUJiaming2GONGShaomin2LUZejun2ZHANGHui2LIUShaopeng2DINGXiaoqiang2ZHONGYihong2

1.DepartmentofNephrology,JiangsuProvinceHospitalofTraditionalChineseMedicine,NanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanjing210029,China; 2.DepartmentofNephrology,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China

AbstractObjective：To explore the potential serum biomarkers of patients with lupus nephritis(LN) by using two-dimensional electrophoresis combined with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry(MALDI-TOF/TOF MS), so as to lay the foundation for illuminating pathogenesis. Methods:A total of 40 LN patients were divided into two groups, the active LN group and the inactive LN group, with 20 in each. In addition, 20 IgA nephritis patients and 20 healthy volunteers were enrolled as IgAN group and healthy control group. Two-dimensional gel electrophoresis was used to separate and analyze the serum proteins, and MALDI-TOF/TOF MS was applied to the identification of the differentially expressed proteins. Results: A total of fifty differentially expressed proteins were identified. Compared with that in healthy control group, 23 differentially expressed proteins were discovered in active LN group and inactive LN group, among which, 8 proteins were up-regulated and 15 proteins were down-regulated. And 18 differentially expressed proteins, compared with IgA nephritis group, were found in active LN group and inactive LN group, including 13 up-regulated proteins and 5 down-regulated proteins. Furthermore, the number of up-regulated and down-regulated proteins in active LN group, compared with those in inactive LN group, were 4 and 5, respectively. Among the 50 identified differentially expressed proteins, the expression of serum amyloid protein A( SAA ) in active LN group was higher than that in the other groups while the expression of complement component C4A in active LN group was lower than that in the other groups. And the expression of chain B (solution structure of double super helix model) in the inactive LN group was higher than that in the other groups. Compared with that in healthy control group, the expression of vitamin D-binding protein isoform 1 precursor, chain A(crystal structure of uncomplexed vitamin D-binding protein) and chain B (a covalent dimer of transthyretin that affects the amyloid pathway) was up-regulated in both active LN group and inactive LN group, while the expression of the vitronectin precursor, ficolin-2 isoform a precursor and chain A (crystal structure of the catalytic domain of human complement C1s protease) was down-regulated. Compared with that in IgA nephritis group, the expression of lipoprotein CIII and vitronectin precursor was up-regulated in both active LN group and inactive LN group. Conclusions: Combination of two-dimensional gel electrophoresis and MALDI-TOF/TOF MS is effective for screening and identification of differentially expressed proteins in serum from LN patients. These differentially expressed proteins could be used as biomarkers for noninvasive diagnosis and evaluation of LN. Further study on these proteins would be conducive to understanding the pathogenesis of LN.

Key WordsSystemic lupus erythematosus;Lupus nephritis;Proteomics;Mass spectrometry;Biomarkers

通讯作者钟一红，E-mail：jennyzhong@msn.com

基金项目：上海市科委基础研究重点项目(编号：08JC1404300)

中图分类号R692

文献标识码A