周丽娜，王洪新

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是中老年人常见的一种以运动迟缓、强直、静止性震颤和姿势反射障碍为主要临床症状的神经系统退行性疾病。脑深部电刺激术(deep brain stimulation，DBS)是将电极埋植于脑深部特定的神经核团，通过颅外脑刺激器发生电脉冲刺激来达到治疗目的。法国的Benabid 医生最初在作核团毁损术前用100～180 Hz 高频刺激来测定手术毁损范围时，发现高频刺激可使PD 症状改善，频率较低时则没有此效果，从而开创了脑深部电刺激术［1］。目前手术常用靶点有丘脑底核(subthalamic nucleus，STN)、苍白球内侧核(globus pallidus internus，GPi)和丘脑腹中间核(ventral intermediate nucleus，Vim)，其中STN-DBS 对震颤、强直、运动迟缓和异动症的治疗效果最为显著，能显著减少用药剂量，并具有非破坏性、可调节性、可逆性和并发症少等优点，是最为理想的刺激靶点。虽然STN-DBS 的临床效果得到肯定，但其作用机理仍不十分清楚。基于此，本研究选用STN 为研究对象，记录正常大鼠和帕金森病大鼠STN-DBS 前后STN 的细胞外放电，分析了其放电频率和放电形式，来进一步的探讨高频电刺激STN 治疗PD 的作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物 选用健康雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠30 只，质量260～290 g，由北京维通利华实验动物有限公司［动物许可证号:SXCK(京)2002-0003］提供。大鼠在标准环境饲养，室温20～28 ℃，24 h 昼夜循环光照，自由饮水进食。动物经行为学测试无旋转行为后进行下一步实验。将大鼠随机分为2 组:正常对照组(n=10)、帕金森病模型组(n=20)。

1.1.2 仪器 脑立体定位仪(美国)、牙科钻(STRONG 90)(韩国)、DigiData 1322A 型生物电信号采集与分析系统(美国Axon 公司)、微电极放大器(AxoClamp-2B)(美国Axon 公司)、手术显微镜(YZ20P5)(美国)、微电极推进器(MS314)(美国Axon 公司)、光学显微镜(日本Olympus 公司)、电刺激器(SEN-7203)(日本SEN 公司)。

1.1.3 试剂 水合氯醛、乌拉坦、氯化钾、6-羟多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)、阿朴吗啡(Apomorphine，APO)。

1.2 实验方法

1.2.1 帕金森病大鼠模型的建立 采用6-OHDA 化学性毁损黑质致密部(substantia nigra compacta，SNc)的多巴胺能神经元的方法建立PD 模型。首先将2 mg 6-OHDA 溶于700 μl 含0.2%抗坏血酸的生理盐水中(浓度约为3 mg/ml)，并置于冰盒内，避光保存。将SD 大鼠用10%的水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉后，将其俯卧位固定于脑立体定位仪上。沿头顶部正中切开头皮和皮下组织，暴露前囟。采用两点注射法，根据包新民等［2］著的大鼠脑立体定位图谱，选择左侧SNc 两点坐标分别为:前囟后5 mm，中线旁开1.9 mm，硬膜下8.0 mm 和前囟后5 mm，中线旁开1.8 mm，硬膜下8.0 mm。做好标记后用牙科钻沿两点周围开一小骨瓣，并在手术显微镜下掀除硬脑膜，暴露脑组织。用10 μl Hamilton 微量注射器通过立体定位注射仪每点注射6-OHDA 溶液4 μl(12 μg)，注射速度为l μl/min，留针10 min，而后缓慢退针，消毒后缝合皮肤。腹腔注射青霉素100000 IU 预防感染。将术后的大鼠置于安静保温处直至清醒，自由进食饮水。毁损4 w 后，给大鼠腹腔注射APO(0.5 mg/kg)诱发旋转行为。于注药后5 min 内出现向健侧(毁损对侧)旋转，身体呈环形，首尾相接，并且30 min 内平均速度大于7圈/分为成功的帕金森病大鼠模型。

1.2.2 STN 电刺激 电生理记录在APO 诱发后2 w 进行，将两组大鼠用30%乌拉坦(1.0 g/kg)腹腔麻醉后置于立体定向仪上，按包新民等的大鼠脑立体定位图谱确定右侧STN 坐标为前囟后3.4～4.2 mm，中线旁开2.0～3.0 mm，硬膜下7.2～8.3 mm。STN 上方的颅骨和硬脑膜被小心移除，把一尖端直径为200 μm 的同心圆刺激电极通过立体定向方法，在矢状面上垂直前倾20°插入STN。通过刺激器进行电刺激，刺激参数为频率130 Hz，波宽0.06 ms，电流强度0.4 mA，刺激时间10 s。

1.2.3 STN 神经元细胞外记录 采用玻璃微电极细胞外记录法记录STN 刺激前120～180 s，刺激中(10 s)和刺激后120～180 s 的STN 神经元放电。电极尖端直径1～2 μm，阻抗10～20 MΩ，充灌液为含1%滂胺天蓝的3 mol/L 氯化钾溶液。细胞放电经微电极放大器(AxoClamp-2B)和生物电信号采集与分析系统显示于计算机，做实时观察、储存，而后用Spike2 软件分离出信噪比大于或等于3∶ 1的信号进行信号分析。进行信号分析。采样时间5～20 min。整个实验过程中将大鼠直肠温度维持在37 ±0.5 ℃。每组记录结束后，给予20 μA 阴极电流10～15 min，微电泳滂胺天蓝到最后一个记录位点。

1.2.4 组织学定位及形态学观察 电生理记录完毕后，将大鼠在过量麻醉下断头取脑，将鼠脑置于4%甲醛溶液中24 h。行连续冠状石蜡切片，并进行HE 染色，以确定记录点的位置和SNc 毁损情况。

1.3 统计学处理 对记录点在STN 内的神经元的电活动进行统计分析，记录位置在STN 之外的神经元信号弃之不用。实验数据采用SPSS11.5 for windows 统计软件包进行统计分析。分析刺激前每个STN 神经元的基础放电活动并计算平均放电频率。放电频率采用表示。通过独立样本t 检验比较对照组和PD 组大鼠STN 神经元放电频率，通过χ2检验比较两组大鼠STN 神经元放电形式，P＜0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 PD 模型的行为检测 进行造模的20 只大鼠，12 只诱发旋转成功，2 只死亡。对照组大鼠无死亡。

2.2 组织学检测 分别观察和分析了对照组大鼠STN 中的42 个神经元和PD 组大鼠STN 中的48 个神经元，病理结果显示刺激点和记录点均位于STN 内。成功诱发的PD 组，毁损区结构紊乱，SNc神经元消失，胶质细胞增生。

2.3 STN 神经元自发放电活动 对照组大鼠神经元的放电频率为16.21 ±1.26 Hz，PD 组大鼠神经元放电频率为17.56 ±1.02 Hz，两组放电频率无显著差异(P ＞0.05)(见表1)。在对照组大鼠，STN神经元表现出3 种放电形式，规则放电的神经元25个(60%)，不规则放电的神经元11 个(25%)，爆发式放电的神经元6 个(15%)。PD 组大鼠STN 神经元也表现出3 种放电形式，规则放电的神经元6 个(14%)，不规则放电的神经元10 个(20%)，爆发式放电的神经元32 个(66%)(见图1)。经χ2检验，对照组和PD 组大鼠STN 神经元放电形式的总体分布不同，PD 组大鼠STN 神经元中爆发放电的神经元明显多于对照组，而规则放电的神经元显著少于对照组(P ＜0.01)(见表1、图2)。

图1 对照组和帕金森病组大鼠STN 神经元的放电形式

图2 对照组和PD 组大鼠STN 神经元放电形式比较

表1 对照组和PD 组大鼠STN 神经元放电形式比较

2.4 电刺激STN 对STN 神经元放电的影响在对正常对照组和PD 组STN 高频刺激过程中，共观察到4 种不同类型的反应(见图3)。正常对照组在10 s 的刺激过程中，放电频率的显著下降(71%)或甚至完全抑制电活动(14%)占绝大多数。平均放电率由刺激前16.21 ±1.26 Hz 到刺激中的8.34±1.12 Hz。只有5%的神经元放电率增加，10%的神经元放电率没有变化。PD 组在电刺激过程中也出现放电率的显著降低(60%)或完全性抑制(17%)。平均放电率为由刺激前17.56 ±1.02 Hz到刺激中的3.34 ±1.02 Hz。放电率增加的神经元上升至6%，17%的神经元放电率没有变化(见表2)。

图3 高频电刺激过程中STN 神经元的4 种反应类型

表2 电刺激STN 对STN 神经元放电的影响

3 讨论

STN 在基底节运动调控系统中占据重要地位。其通过传入和传出纤维与大脑皮质、苍白球、黑质和脑干等与运动调控的相关结构存在广泛联系。抑制性的苍白球外侧部(globus pallidus pars externa，GPe)-STN 通路和兴奋性的STN-黑质网状部(substantia nigra pars reticularis，SNr)/苍 白 球 内 侧 部(globus pallidus pars interna，Gpi)通路，是STN 主要的生理调节系统。因此STN 被描述成基底节活动的“动力”源泉。PD 状态下在间接通路中，因SNc至纹状体的多巴胺(dopamine，DA)能通路变性，引起纹状体神经元D2 受体的抑制减弱，于是自纹状体至GPe 的γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)能作用加强，GPe 处的GABA 能神经元受到过分抑制，自GPe 至STN 的GABA 能通路的抑制作用减弱，从而导致STN 的作用过强，又因STN 作用过强就转而引起Gpi/SNr 复合体对丘脑抑制性作用加强。导致丘脑对皮质运动区的兴奋作用减弱，故PD患者运动减少、肌强直、平衡障碍、姿势异常和语音低沉。还有研究表明STN 高兴奋性可是SNc 放电产生同步化效应，导致SNc 多巴胺能神经元释放DA 增加，暂时维持脑内直接通路与间接通路的相互平衡，而STN 兴奋性传出纤维过度释放谷氨酸(glutamic acid，Glu)，促进DA 能神经元的损伤，从而加速PD 症状的发展［3］。因此STN 的过度活性和其传出靶区的过度兴奋现在已被认为是PD 的病理生理标志。

近十年来，STN 的高频电刺激术(high-frequency stimulation，HFS)正被越来越多的用于治疗PD。虽然其的临床效果得到肯定，但其作用机理仍不十分清楚。目前认为DBS 治疗帕金森病的可能机制有［4～6］:(1)DBS 能提高纹状体区多巴胺的代谢活性，并增加乙酰胆碱M 受体从STN 转移到丘脑，提高丘脑乙酰胆碱的浓度。(2)DBS 能增加丘脑、小脑、中脑和皮质区域的血流量。(3)DBS 能抑制从STN 到其他靶点投射的谷氨酸神经纤维的活性，降低兴奋性神经元的过度激活。(4)DBS 能对异常STN 神经元兴奋性的调控，改变相关的联系核团的异常功能状态，使基底核运动环路正常调控功能重新恢复。

基于以上研究的基础，本研究选用6-OHDA 单侧毁损制备的旋转PD 大鼠模型，探讨STN-DBS 治疗帕金森病的机制。本研究结果表明，电刺激前PD模型大鼠STN 神经元放电频率与对照组无显著差异，而放电形式发生改变，正常大鼠大部分STN 神经元表现为规则或不规则放电，PD 模型大鼠爆发放电的神经元显著增多，这和既往的研究结果基本一致。在同样的放电频率下，爆发放电比规则放电更有效，因此爆发放电可以说是高兴奋性，进一步证实了PD 状态下STN 神经元的过度活性。同时本研究表明，高频电刺激两组大鼠丘脑底核神经元后，两组丘脑底核神经元放电都主要表现为部分抑制或完全抑制，与以往的研究结果有较好的一致性［7，8］。该研究结果支持了高频刺激可失活刺激点附近的神经细胞，抑制丘脑底核的异常放电活动，这可能是脑深部电刺激治疗帕金森病的可能机制之一。本实验提示HFS-STN 可能通过抑制STN 的过度活性而改善帕金森病的症状。

综上，本研究采用细胞外单位记录的方法记录刺激前和刺激过程中丘脑底核神经元的放电，结果表明爆发式放电增多可能是帕金森发病潜在的电生理基础，高频电刺激丘脑底核可抑制丘脑底核的异常放电活动，这可能是脑深部电刺激治疗帕金森病的可能机制之一。但基底节神经环路相当复杂，有关帕金森病的病理生理学机制及HFS-STN 治疗帕金森病的机制还有待更深入的研究。

［1］Benabid AL，Pollak P，Gervason C，et al.Long-term suppression of tremor by chronic stimulation of the ventral intermediate thalamic nucleus［J］.Lancet，1991，337:403-406.

［2］包新民，舒斯云.大鼠脑立体定位图谱［M］.北京:人民卫生出版社，1991.44-48.

［3］Shaw VE，Peoples C，Spana S，et al.Patterns of Cell Activity in the Subthalamic Region Associated with the Neuroprotective Action of Near-Infraed Light Treatment in MPTP-Treated Mice［J］.Parkinsons Dis，2012，12:2968-2975.

［4］Steigerwald F，Volkmann J.Deep brain stimulation for movement disorders［J］.Nervenarzt，2012，83(8):988-993.

［5］张建国，马 羽，刘焕光.深部脑电刺激术在中国的发展现状［J］.中国神经精神疾病杂志，2009，35(7):385-387.

［6］刘金龙，陈 玲，柯春龙，等.深部脑电刺激术帕金森近期疗效的初步探讨［J］.中国神经精神疾病杂志，2009，35(4):208-211.

［7］Filali M，Hutchison WD，Palter VN，et al.Stimulation-induced inhibition of neuronal firing in human subthalamic nucleus［J］.Exp Brain Res，2004，156(3):274-281.

［8］Welter ML，Houeto JL，Bonnet AM，et al.Effects of high-frequency stimulation on subthalamic neuronal activity in parkinsonian patients［J］.Arch Neurol，2004，61(1):89-96.