陈 勇，方 宁，陈代雄，赵春华

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是一种常见于中老年人群的第二大中枢神经系统退行性疾病。PD 的发生与蛋白质二硫键异构酶、Parkin 基因等多种因素有关，其病理表现为大脑黑质多巴胺能神经元的变性、缺失，导致多巴胺神经递质减少［1，2］。PD的治疗手段以药物治疗和手术治疗为主，但均只能缓解症状，且有发生不良反应和并发症风险［3］。目前，细胞治疗PD 患者或动物模型已取得很大成功，可望成为治疗PD 的新手段和趋势［4～6］。人羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cells，hAECs)源于胎盘羊膜组织，研究显示，hAECs 具有明显的可塑性和多向分化潜能，在不同体外诱导条件下，可分化成来源于3 个胚层的不同组织细胞类型，同时其还具有低免疫原性和免疫调节作用［7～10］。此外，hAECs获取无侵入性伤害、易于制备、无伦理限制等优势。本实验通过动态行为学观察，评价原位移植hAECs 对PD 模型大鼠的疗效及其在脑组织中的存活、分化。

1 材料和方法

1.1 材料 清洁级雌性Wistar 大鼠30 只，体重220～250 g，购自第三军医大学大坪医院动物实验中心［许可证号:SCXK(渝)2007-0005］。LGDMEM 培养基和FBS(GIBCO，乌拉圭);GlutaMax(GIBCO 公司，美国);小鼠抗人细胞核抗体(MAB1281;Chemcion，美国);兔抗人神经元微管结合蛋白(microtubule associated protein-2，MAP-2)抗体(SANTA CRUZ，美国);阿朴吗啡(Apomorphine，APO)、6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)和小鼠抗人角蛋白(CK19)抗体(Sigma，美国);流式细胞术检测抗体CD29-PE，CD34-PE，CD45-FITC，CD44-FITC，CD73-PE，CD71-PE，CD80-FITC 和CD86-PE(BD，美国);兔抗大鼠酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase，TH)抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 hAECs 的分离、培养及表型分析 经产妇知情同意采集足月剖宫产羊膜，采用胰蛋白酶消化法分离hAECs，将分离的hAECs 悬浮于含10%FBS、1% GlutaMAX、55 μmol/Lβ-巯基乙醇和1%NEAA 的L-DMEM 培养基中，按5 ×105/cm2接种于培养瓶，于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养。细胞生长面积达80%以上即进行传代培养，第3 代细胞用于细胞移植，并采用流式细胞仪(FACS Calibur.BD)检测其表型。取第3 代hAECs，按组合方案加入荧光素标记的CD29-PE，CD34-PE，CD44-FITC，CD73-PE，CD80-FITC 和CD86-PE 的抗体振荡混匀，每份样品的采集细胞数≥104个，Cell Quest 软件进行表型分析。同型对照抗体为相应的荧光素标记的小鼠IgG。制备第3 代hAECs 爬片，进行免疫组化染色检测CK19。

1.2.2 模型制备 大鼠用7%水合氯醛腹腔麻醉(0.5 ml/100 g)，固定于脑立体定位仪上，按Leaver 等［11］方法，参照大鼠脑立体定向图谱确定右侧前脑内侧束(medial forebrain bundle，MFB)，坐标:前囟后4.6 mm，矢状缝左侧1.2 mm，颅骨骨膜下8.2 mm。用微量注射器3 μl 6-OHDA(0.1% Vit C 临用前配制，浓度4 μg/μl)注入MFB，注射速度1 μl/min，留针15 min，退针速度为1 mm/min。建模后1 w，腹腔注射多巴胺受体激动剂APO 0.5 mg/kg 诱导旋转，每周1 次连续4 w。若每次大鼠均以损毁侧下肢为支撑点向健侧(左侧)旋转，而且30 min 内平均旋转次数超过7 转/min，视为造模成功［12］。假手术组以生理盐水代替6-OHDA，其余操作同模型组。

1.2.3 实验分组与细胞移植 PD 模型大鼠随机分为模型组、hAECs 原位移植组和假手术组，每组10 只。取第3 代hAECs 用不含血清的L-DMEM 培养基悬浮。原位移植组于造模注射位点注射8 μl hAECs 悬液(含3 ×105个细胞)，模型组同步注射等体积L-DMEM 培养基。

1.2.4 行为学观察 细胞移植后各组PD 大鼠每周定时腹腔注射APO(0.5 mg/kg)诱导PD 样症状，待大鼠旋转稳定后，摄像记录5 min 内大鼠旋转次数(连续观察10 w)。

1.2.5 hAECs 存活及分化检测 分别于hAECs 移植后2 w 和12 w 每组取5 只大鼠，腹腔注射7%水合氯醛麻醉，经心插管依次用生理盐水和4%多聚甲醛后，取脑组织置于4%多聚甲醛4 ℃固定，梯度蔗糖脱水，原位移植区连续冰冻切片，片厚20 μm。切片经通透、封闭，滴加MAB1281 和MAP-2 抗体混合液4 ℃孵育过夜，用PBS 替代一抗作为对照。滴加 PE 标记的羊抗小鼠 IgG (针对MAB1281)与FITC 标记的羊抗兔IgG(针对MAP-2)混合液，DAPI 复染，甘油封片，荧光显微镜下观察。

1.2.6 酪氨酸羟化酶免疫组化染色 冰冻切片3%H2O2去离子水孵育10 min，PBS 漂洗，滴加TH 抗体(1∶ 300 稀释)，4 ℃孵育过夜，PBS 漂洗，DAB 显色，冲洗，光学显微镜下观察。

1.2.7 统计学方法 采用SPSS 17.0 统计软件进行分析，数据以()表示，组间比较采用独立样本t 检验，以P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 hAECs 形态及表型特征 hAECs 呈典型的贴壁生长特性，形态呈铺路石样，鹅卵石状(见图1A)。第3 代hAECs 表达CK19(见图1B)。流式细胞术分析结果显示，第3 代hAECs 不表达CD 34、CD 80 和CD 86，高表达CD 73、CD 44 和CD 29(见图2)。

图1 hAECs 形态

图2 hAECs 流式细胞术表型分析

2.2 hAECs 移植后PD 大鼠行为学变化 假手术组无1 例出现旋转行为。hAECs 原位移植组大鼠于移植后2 w 开始旋转次数均明显减少(均P ＜0.05);至10 w，原位移植组大鼠旋转次数仍明显低于模型组(均P ＜0.05)(见图3)。

图3 hAECs 移植后PD 大鼠行为学变化

2.3 hAECs 在脑内存活与分化 hAECs 移植后2 w 和12 w，原位移植组原位移植区脑组织均可见人细胞核特异性抗原阳性细胞(呈红色荧光)，其中部分阳性细胞表达MAP-2(呈绿色荧光)(见图4)。

图4 hAECs 原位移植后表达MAP-2(免疫荧光染色，×400)

2.4 酪氨酸羟化酶的表达 hAECs 移植后2 w，原位移植组大鼠黑质纹状体TH 表达较对照组(control)明显上调，假手术组(sham lesioned)TH 表达最高(见图5)。

图5 移植后2 w 各组大鼠黑质酪氨酸羟化酶的表达

3 讨论

PD 动物模型是研究PD 发病学和治疗学重要的生物模式。目前建立PD 模型主要用药物1-甲基-4-苯基-四氢吡啶(MPTP)或6-羟基多巴胺(6-OHDA)损毁DA 能神经元从而模拟PD 的病症［13］。6-OHDA 建模致细胞损伤严重，模型稳定且持久，行为学表现典型［14］，MPTP 建模方法简便，成功率较高但行为学不典型，但停药后病理症状可逆。MFB 是通过下丘脑外侧区的一束神经纤维，连接隔区、下丘脑和中脑的被盖部位，黑质致密部的DA 神经元的轴突可以通过MFB 投射到纹状体。本实验借助立体定位仪单点注射6-OHDA 定向损毁MFB，成功建立了PD 大鼠模型。行为学动态观察显示，hAECs原位移植组大鼠于移植后2 w 开始，旋转次数均明显减少，且在观察满10 w 时未见反弹。

hAECs 在异基因宿体体内的存活及分化是学科界关注的重要问题。体外诱导培养研究证明，hAECs 在特定的诱导条件下可分化为神经元、胶质细胞和少突胶质细胞［15］。杨新新［16］报道hAECs 植入大鼠侧脑室后表达TH，提示hAECs 可在病损脑组织分化成DA 能神经元。MAP-2 主要表达于成熟神经元的胞浆和树突，TH 既是多巴胺合成的限速酶，也是DA 能神经元特异性标志之一，黑质TH 含量和活性降低及由此导致的DA 匮乏是PD 发病的主要环节［17］。本实验采用免疫荧光和免疫组化染色观察到hAECs 原位移植后12 w，大鼠脑损毁原位可见MAB1281 阳性细胞，说明移植的hAECs 至少可在模型动物脑组织内存活12 w 而未被排斥，这种免疫豁免特性与其不表达共刺激分子CD80(B7-1)和CD86 (B7-2)有关。进一步观察发现部分MAB1281 阳性细胞表达MAP-2，脑损毁区TH 呈阳性，提示移植的hAECs 可在移植区分化成为多巴胺神经元样细胞，hAECs 改善PD 模型大鼠运动行为可能与其促进黑质TH 表达有关。

hAECs 移植治疗神经损伤的机制尚不明确。Palmatir 等［18］发现人、猴和鼠的羊膜组织中存在可溶性的促进神经细胞生长的物质，能促进培养的脊髓后跟神经节细胞生长。进一步的研究证明羊膜细胞含有胰岛素样生长因子、转移生长因子、前列腺素、和表皮生长因子样物质等因子，对神经元细胞起到营养作用［19～21］。hAECs 可通过分泌神经营养因子(Neurotrophic factors，NTFs)，NTFs 和可溶性炎症抑制因子可缓解黑质多巴胺神经元的进行性退化和凋亡［22，23］，使病程得以缓解。至于由hAECs 分化而来的具有某些多巴胺能神经元特征的细胞是否起到了对PD 大鼠多巴胺能神经元的补偿，并起到神经功能重建的作用，目前尚不清楚，除非能证明由供体细胞分化而来的神经元样细胞之间及与宿主神经元之间确建立了新的神经元环路。这是值得深入研究的重要内容，对揭示细胞治疗神经系统疾病的生物学机制具有重要意义。

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