杨斯琴，敖日格乐*，王纯洁，周 婷

(1.内蒙古农业大学 动物科学学院，内蒙古 呼和浩特 010018；2.内蒙古农业大学 兽医学院，内蒙古 呼和浩特 010018)

致病性大肠杆菌(Escherichia coli)为导致畜牧业中细菌性疾病最常见的病原，不同动物感染后出现不同的临床症状和病理变化，而且常与其他病原菌混合感染或并发，发病率和死亡率较高，给养殖业带来严重的经济损失[1]。因此，致病性E.coli 的检测尤为重要。尽管致病性E.coli 通常集中于某些特定的血清型，但众多研究发现相同血清型E.coli 的病原生物学特性也不尽相同。不同地区血清型差别较大，同一地区不同牧场血清型存在差异，同一牧场相同牧群也存在不同的血清型[2]。因此，E.coli 的致病性并不完全与血清型有关，而主要是取决于其所产生的特定的毒力因子，如菌毛、铁摄取系统、外膜蛋白以及毒素等。毒力基因的检测己成为确定致病性E.coli 的常用方法[3]。因此毒力基因的测定不仅可以作为特征性鉴定，而且还可对其潜在的致病性能做出前瞻性判定。另一方面，目前由于滥用抗生素导致耐药致病性E.coli 不断出现，防治效果也愈来愈不理想。为了解不同血清型致病性E.coli的毒力基因携带情况和耐药性，本研究采集内蒙古地区奶牛直肠粪便样品，对其进行致病性E.coli 分离鉴定，并进行毒力基因、血清型检测和药敏试验研究，为防治由致病性E.coli 所引起的各种疾病提供参考。

1 材料和方法

1.1 临床样品、实验动物及主要试剂 100 份新鲜粪便样品于2013 年6 月采自内蒙古呼和浩特地区3个规模化奶牛场的成年奶牛。昆明系健康小鼠(体质量为20±2 g)购自内蒙古大学动物中心。麦康凯培养基、伊红美蓝琼脂培养基(EMB)、普通营养琼脂培养基、普通肉汤培养基、糖发酵培养基、西蒙氏枸橼酸盐培养基、0.5 %石炭酸生理盐水、革兰染色液、吲哚试剂、M-R 试剂、V-P 试剂均购自广东环凯微生物科技有限公司；Premix TaqTM、100 bp DNA Ladder、细菌基因组DNA 提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒等均购自TaKaRa 公司；E.coli 标准“O”抗原定型血清购自国家兽医微生物菌种保藏中心；20 种药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司。

1.2 E.coli 的分离鉴定 参照文献[4]的方法对粪便样品进行分离并纯培养，挑取菌落涂片染色镜检，观察菌体形态及染色特性。取37 ℃培养18 h 的肉汤纯培养物，进行常规生化试验。按生化鉴定管使用说明书进行鉴定。

1.3 致病性试验 将各分离株菌液(0.5×109cfu/mL)分别按0.2 mL/只剂量腹腔注射2 只小鼠，空白对照组的2 只小鼠注射灭菌营养肉汤0.2 mL[5]。将实验小鼠隔离饲养，观察发病及存活情况。对死亡的小鼠立即剖检并无菌取其脏器样品(包括肝脏、脾脏、心血)划线于EMB 平板，经革兰氏染色、镜检，培养特性、形态、染色等均符合E.coli 特征的菌株确定为致病性E.coli[6]。

1.4 分离株的血清型鉴定 对经生化鉴定和小鼠致病性试验鉴定为致病性E.coli 的菌株进行普通琼脂纯培养，利用生理盐水洗涤纯培养物，3 000 r/min 离心15 min，洗涤2 次，稀释成108个/mL 菌液，121 ℃高压灭菌2 h，破坏其K 和H 抗原，即为“O”抗原。按血清鉴定使用说明书采用玻片凝集试验进行鉴定。

1.5 分离株的毒力基因检测及测序 根据文献[7]和[8]设计并合成stx1、stx2、bfpA、eaeA、st、lt、irp2 和hlyA 等毒力基因的8 对引物，引物由TaKaRa公司合成。采用细菌基因组DNA 提取试剂盒提取分离株DNA，以其为模板对8 种毒力基因进行PCR扩增，PCR 产物经胶回收试剂盒回收并由中美泰和生物技术(北京)有限公司测序。

1.6 药敏试验 按照CLSI 标准[9]采用纸片稀释法进行药敏试验[1]。根据CLSI 的抑菌圈大小进行判断。以E.coli ATCC25922 作为药敏试验的质控菌。

2 结果

2.1 E.coli 的分离鉴定 粪便样品经多种分离培养基培养后结果显示，分离菌株在麦康凯琼脂培养基上呈现玫瑰红色菌落；EMB 平板上呈现黑紫色并且对光具有金属光泽的菌落；普通琼脂培养基上呈现圆形、边缘整齐、表面光滑、半透明的菌落；普通肉汤中液体浑浊、表面有菌膜、底部有沉淀即菌体。100 份粪便样品中共分离出88 株疑似E.coli，经生化鉴定其中有77 株确定为E.coli。

2.2 分离株的致病性试验 将各分离株菌液分别腹腔注射小鼠后进行致病性试验，结果显示，77 株E.coli 分离株中有50 株E.coli 均在12 h～48 h 内致小鼠死亡(64.9 %)，而对照组小鼠无任何变化。实验组小鼠注射分离鉴定的E.coli 后出现昏睡，厌食，呼吸急促，被毛蓬松，少数可见拉稀和眼角出血。剖检死亡小鼠可见腹腔内有黏性黄色渗出物，肝脏和肾脾肿大，有点状坏死灶；肺充血及淤血，肠严重膨胀充气。将死亡小鼠心血接种于EMB 琼脂进行培养后革兰氏染色、镜检，培养特性、形态、染色等均符合接种菌的特性。

2.3 分离株的血清型鉴定结果 分离株经玻片凝集试验进行血清型鉴定，结果显示50 株致病性E.coli中18 株有自凝现象，8 株未定型；其余24 株定型血清型(表1)，分别为10 种不同的血清型，包括O1、O2、O8、O18、O78、O86、O114、O118、O146和O152血清型，其中O18、O146和O152为主要流行的血清型，分别占定型血清的25 %、17 %和17 %。

表1 致病性E.coli 的血清型鉴定结果Table 1 Identification of serotype of pathogenic E.coli

2.4 分离株的毒力基因检测及测序结果 对分离株的8 种毒力基因进行PCR 检测，结果显示，50 株致病性E.coli 中，毒力基因irp2 的检出率为100 %；毒力基因eaeA、stx1、stx2 和hlyA 的检出率分别为50 %、14 %、10 %和8 %；而毒力基因bfpA、st 和Lt 的检出率为阴性(0/50)(表2)。此外同时含有stx1和irp2 2 种毒力基因，stx1、irp2 和hlyA 3 种毒力基因，stx1、stx2、irp2 和hlyA 4 种毒力基因的菌株各有1 株；同时含有stx1、stx2、eaeA 和irp2 4 种毒力基因，stx1、eaeA、irp2 和hlyA 4 种毒力基因，stx2、eaeA 和irp2 3 种毒力基因的菌株各2 株；同时含有eaeA 和irp2 2 种毒力基因的菌株共有19 株；只含有irp2 毒力基因的菌株有22 株(表2)。毒力基因的PCR 产物测序结果与GenBank 参考序列相似度均高于97%。8 种毒力基因的PCR 结果见图1。

表2 致病性E.coli 的毒力基因检测结果Table 2 Detection of virulence genes of pathogenic E.coli

图1 致病性E.coli 的8 种毒力基因的PCR 检测结果Fig.1 Detection of 8 kinds of virulence genes of pathogenic E.coli by PCR

2.5 致病性E.coli 耐药性的检测结果 在血清型鉴定和毒力基因检测的基础上，从每种血清型中挑选1 株并含有毒力基因最多的10 株代表分离株，测定其对20 种抗生素的耐药性。结果显示，所有血清型菌株均表现为多重耐药性，其中10 种血清型致病性E.coli 均对青霉素、四环素、多西环素、利福平、复方新诺明和阿莫西林6 种抗生素具有耐药性；70%的致病性E.coli 表现为链霉素耐药；50 %的致病性E.coli 对头孢曲松和头孢噻吩耐药(表3)。

表3 致病性E.coli 血清型的耐药表型和毒力基因的分布Table 3 Resistance phenotype and distribution of virulence genes in relation to pathogenic E.coli serotypes

3 讨论

关于致病性E.coli 的检出率各个国家及地区各不相同。有报道显示，牛致病性E.coli 的检出率为28.43 %[10]，羊致病性E.coli 的检出率为48 %[11]。而本研究中，100 份新鲜粪便样品中致病性E.coli 的检出率为50 %，其检出率远远高于上述报道，表明致病性E.coli 的检出率具有地域性和宿主性。

近几年内蒙古地区E.coli 主要血清型分别有O78、O2、O8、O86、O35、O1，其所占的比例分别为38.89%、33.33 %、14.81 %、7.41%、3.70 %、1.85 %[12]。而本研究中优势血清型为O18、O146和O152，所占比例分别为25%、17%和17%。因E.coli 血清型复杂，同种动物不同地区E.coli 的血清型具有明显差异，因此优势血清型同样具有地域性和宿主性。而对于未定型的分离株，可能由于时间和地点的推移，出现了新的致病性血清型，有待于进一步研究。

E.coli 是临床上分离率较高的菌株，为区分E.coli 分离株是否为致病性菌株，本研究结合动物实验和PCR 方法对其进行鉴定。结果显示，分离株在12 h～48 h 内致小鼠死亡并均含有8 种毒力基因(stx1、stx2、bfpA、eaeA、st、lt、irp2 和hlyA)中的某一种或几种，因此鉴定为致病性菌株。

强致病性毒力岛(High pathogenicity island，HPI)首先在耶尔森菌中发现，是赋予耶尔森菌毒力和致病性的重要因素。而毒力基因irp2 作为HPI 中的铁调节基因，仅存在于强致病株中，与毒力密切相关，成为判断和检测其它病源菌是否存在HPI 的标志基因[13]。而本研究中毒力基因irp2 的检出率为100 %，并且致病性E.coli 为条件致病菌，因此认为内蒙古地区牛场存在潜在危险，需加强管理，加以防范E.coli 病的暴发。而有些致病性E.coli 存在4种毒力基因，推测这些毒力基因在疾病发生过程中发挥着非常重要的作用。

药敏试验结果表明不同血清型致病性E.coli 的耐药性存在差异，在使用抗生素治疗E.coli 型疾病时应先做初步的血清型监测及药敏试验，以筛选出其敏感药物。本研究中所有受试菌对7～12 种抗菌药物表现出耐药性，而且10 种血清型致病性E.coli对青霉素、四环素、多西环素、利福平、复方新诺明和阿莫西林6 种抗生素均耐药。因此，内蒙古地区可以减少以上6 种抗生素的使用或配合其他药物进行治疗。本研究为内蒙古地区牛源致病性E.coli病的防控和临床合理用药提供依据。

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