张宇霞，昝占全，王统霞，李春梅，纪兰菊#（.青海益欣药业有限责任公司，西宁 80003；2.中国科学院西北高原生物研究所/中国科学院藏药研究重点实验室，西宁 8000；3.中国科学院大学生命科学学院，北京 00049）

丹珍头痛胶囊是青海益欣药业有限责任公司原研独家产品，由高原丹参、夏枯草、熟地黄、珍珠母、鸡血藤、川穹、当归、白芍、菊花、蒺藜、钩藤、细辛共十二味中、藏药材组成，具有平肝熄风、散瘀通络、解痉止痛的功效，可用于肝阳上亢、瘀血阻络所致的头痛、背痛颈酸、烦躁易怒等症，特别是针对脑供血不足、高血压脑外伤后遗症、偏头痛、神经衰弱、颈椎病等引起的多发性、慢性头痛具有疗效显著、标本兼治的综合效果，在临床上用于治疗偏头痛[1]、血管神经性头痛[2]。

患者用药的安全性与药品生产工艺的稳定性、质量标准的完善和提高密切相关。目前，丹珍头痛胶囊标准中可监控的药材仅有高原丹参[薄层色谱（TLC）鉴别丹参酮ⅡA]和白芍[TLC鉴别芍药苷、含量测定芍药苷）两味药材。笔者曾对该药品中其他药材的主要成分进行了TLC鉴别及高效液相色谱（HPLC）法测定含量，以期完善其质量标准，但都受到了不同程度阴性干扰。化学指纹图谱可用于全面评价药材或者药品的质量，如红外指纹图谱[3]、气相色谱-质谱（GC-MS）指纹图谱[4]、HPLC 指纹图谱[5]、TLC 指纹图谱[6]等。由于该药品中含中药材种类较多，化学成分复杂，考虑到指纹图谱可以全面反映样品中的化学信息，同时近年来HPLC指纹图谱用于药品质量评价也较多[7-10]，在本研究中笔者对丹珍头痛胶囊进行了HPLC指纹图谱研究并对其进行相似度评价，以为完善丹珍头痛胶囊的质量控制方法提供参考。

1 材料

515型HPLC仪，包括溶剂管理系统、二极管阵列检测器、Empower 色谱工作站（美国Waters 公司）；KQ-100B 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；ESJ182-4型电子天平（沈阳龙腾电子有限公司）；HH-4型数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）。

丹珍头痛胶囊（批号：20131105、20131203、20131204、20140602、20140603、20140607、20140608、20140609、20140 601、20140602，编号为S1～S10）由青海益欣药业有限责任公司提供；阿魏酸、芍药苷、绿原酸、木犀草苷、3，5-O-双咖啡酰基奎宁酸、丹酚酸B、丹参酮ⅡA、迷迭香酸对照品的质量浓度分别为0.012 0、0.029 4、0.030 9、0.040 9、0.030 5、0.136 0、0.016 0、0.312 0 mg/ml（批号分别为MUST-13090901、MUST-11090902、MUST-11090911、MUST-12090901、MUST-14090901、MUST-14090908、MUST-15090906、MUST-16090903）均购自成都曼思特生物科技有限公司；甲醇、乙腈为色谱纯，磷酸为分析纯，水为纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Dikma Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A为水，流动相B为甲醇-乙腈（1∶1，V/V），梯度洗脱（0～10 min，15%→25%B；10～20 min，25%→40%B；20～60 min，40%→90%B；60～65 min，15%B）；流速：1.0 ml/min；检测波长：340 nm；柱温：40 ℃；进样量：20 μl；记录时间：65 min。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 取阿魏酸、芍药苷、绿原酸、木犀草苷、3，5-O-双咖啡酰基奎宁酸、丹酚酸B、丹参酮ⅡA、迷迭香酸对照品各适量，加入甲醇制成每1 ml 含0.012 0 mg 阿魏酸、0.029 4 mg 芍药苷、0.030 9 mg 绿原酸、0.040 9 mg 木犀草苷、0.030 5 mg、3，5-O-双咖啡酰基奎宁酸、0.136 0 mg 丹酚酸B、0.016 0 mg 丹参酮ⅡA和0.312 0 mg 迷迭香酸的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 将丹珍头痛胶囊粉末过七号筛，精密称取约1.5 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 ml，称定质量，回流提取2 h，放冷，用甲醇补足缺失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，经0.45 μm微孔滤膜滤过，得供试品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样6 次，记录峰面积。结果，相似度均为0.90以上。以第11号峰为对照峰S，测定6次色谱中各共有峰的相对保留时间及相对峰面积比值的一致性。结果，RSD分别为0.09%（阿魏酸）、0.10%（芍药苷）、0.20%（绿原酸）、0.15%（木犀草苷）、0.12%（3，5-O-双咖啡酰基奎宁酸）、0.09%（丹酚酸B）、0.12%（丹参酮ⅡA）、0.20%（迷迭香酸），说明仪器精密度良好，符合指纹图谱技术要求。

2.3.2 稳定性试验 取同一样品（编号：S8）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别于放置2、4、6、8、10 h 时按“2.1”项下色谱条件连续进样6 次，记录峰面积。结果，相似度均为0.90以上。以第11号峰为对照峰S，测定6次色谱中各共有峰的相对保留时间及相对峰面积比值的一致性。结果，RSD 分别为0.15%（阿魏酸）、0.16%（芍药苷）、0.20%（绿原酸）、0.15%（木犀草苷）、0.21%（3，5-O-双咖啡酰基奎宁酸）、0.19%（丹酚酸B）、0.11%（丹参酮ⅡA）、0.22%（迷迭香酸），说明供试品溶液在10 h内基本稳定。

2.3.3 重复性试验 取同一样品（编号：S8）适量，共6 份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件连续进样6 次，记录峰面积。结果，相似度均为0.90 以上。以第11号峰为对照峰S，测定6次色谱中各共有峰的相对保留时间及相对峰面积比值的一致性。结果，RSD分别为0.15%（阿魏酸）、0.17%（芍药苷）、0.20%（绿原酸）、0.14%（木犀草苷）、0.20%（3，5-O-双咖啡酰基奎宁酸）、0.19%（丹酚酸B）、0.12%（丹参酮ⅡA）、0.23%（迷迭香酸），说明本方法重复性良好，符合指纹图谱技术要求。

2.4 样品指纹图谱的建立及相似度评价

取10批样品各适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，将所得的HPLC 图谱导入国家药典委员会《中药指纹图谱相似度评价系统（2004A）》软件，选择批号20131203的药品为参照图谱，以平均数法生成对照指纹图谱，时间窗宽度为0.10 min，对比色谱图，确定共有峰为13个，详见图1。以色谱峰稳定、重复性较好的第11号峰为对照峰S，各共有峰相对保留时间比值的RSD为0～0.27%，说明10 批样品中13 个共有峰都能稳定出现。而相对峰面积比值的RSD最高却达到60%以上，说明各批样品中13个共有峰的含量相差较大，故需提高对该药品的质量控制。对10 批丹珍头痛胶囊进行相似度评价，相似度均大于0.90，详见表1。

图1 10批丹珍头痛胶囊高效液相色谱指纹图谱Fig 1 HPLC fingerprint chromatogram of 10 batches of Danzhen headache capsules

表1 10批丹珍头痛胶囊的相似度计算结果Tab 1 Results of similarity of 10 batches of Danzhen headache capsules

3 讨论

3.1 提取方法的选择

分别对提取溶剂（甲醇、乙酸乙酯、甲醇-乙酸乙酯、无水乙醇）、提取时间（0.5、1、1.5、2、2.5 h）、提取方法（回流、超声）、料液比（1∶16、1∶20、1∶50、1∶100）、样品粒度（过四号筛、过七号筛）进行考察，发现以甲醇回流、提取时间2 h、提取料液比1∶16、样品粒度为过七号筛时，峰的数量、分离度及峰形均较好。

3.2 色谱条件的优化

在样品指纹图谱条件摸索过程中，分别以甲醇（乙腈）-水、甲醇（乙腈）-0.01%磷酸缓冲液、甲醇-乙腈-水、甲醇-乙腈-0.01%磷酸缓冲液为流动相，且试用不同的梯度，最后确定选择流动相A为水、流动相B为甲醇-乙腈（1∶1，V/V）、梯度洗脱时，各峰分离度较好。

3.3 检测波长的选择

采用二极管阵列检测器对样品进行200～400 nm 全波长扫描，发现340 nm 波长处检测到的峰数目较多，且分离度较好，故确定340 nm为检测波长。

3.4 指纹图谱数据分析

10批丹珍头痛胶囊中13个共有峰的相对保留时间和相对峰面积计算结果显示，各共有峰出峰时间基本稳定，但共有峰对应的化合物含量差异较大，可能与药材的产地、采收期、采收年限、贮藏及生产工艺控制等因素有关。故需重视药材来源，选用优质药材，严格控制生产工艺，保证药品的质量。

综上所述，该方法简便、准确、重复性好，可用于丹珍头痛胶囊的工艺稳定性评价和质量控制。

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