於学良，张根元（1.苏州卫生职业技术学院，江苏苏州 15009；.南京工业大学江苏省药物研究所有限公司，南京 10009）

咪喹莫特（Imiquimod）化学名称为1-异丁基-4-氨基-1H-咪唑并[4，5-C]喹啉，分子式为C14H16N4，能够在用药局部诱导生成多种细胞因子及相关产物，产生免疫调节和间接抗病毒作用，临床上用于治疗成人外生殖器和肛门的疣/尖锐湿疣[1]。咪喹莫特在国内属于国家二类新药，主要剂型为乳膏剂。经查阅相关文献资料，未见报道咪喹莫特乳膏的透皮吸收研究。本文采用体外扩散池法，选用断奶1～10 d的小型猪背部皮肤模拟人体皮肤进行透皮吸收研究，以制剂中咪喹莫特透皮吸收量为指标，建立了以反相高效液相色谱（RP-HPLC）法检测咪喹莫特体外透皮吸收量的方法。结果表明，该方法能使样品得到较好的分离，排除辅料的干扰，且操作快速、简便、准确、重复性好，适用于产品的质量控制和体外透皮吸收量的检测。本文为外用制剂的体外透皮吸收提供了一个较好的研究方法，并为本品供皮肤局部使用提供了临床科学依据。

1 材料

1.1 仪器

Alltech 626型HPLC仪（美国Alltech公司）；YB-P6智能透皮试验仪（天津药典标准仪器厂）。

1.2 药品与试剂

咪喹莫特对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100632-200401，纯度：98%）；咪喹莫特乳膏（批号：20090801、20090802、20090803，规格：150 mg∶3 g）、空白乳膏均由江苏中丹制药有限公司提供；进口咪喹莫特乳膏（商品名：艾达乐，美国3M Health Care有限公司，批号：GKE069C，规格：12.5 mg∶250 mg）；甲醇、磷酸二氢钾、聚乙二醇400（PEG400，批号：090616）均由上海凌峰化学试剂有限公司提供，均为化学纯。

1.3 动物

2 方法与结果

2.1 离体皮肤的制备

取小型乳猪，颈动脉放血处死，剥离背部皮肤，分离皮下组织及脂肪，用生理氯化钠溶液洗净，置于生理氯化钠溶液中，冷冻保存，1周内使用。

2.2 检测波长的确定

取咪喹莫特对照品适量，用“2.3”项下流动相溶解并稀释制成每1 ml中约含3µg的溶液，在200～400 nm波长范围内进行扫描。结果咪喹莫特在流动相溶液中于244 nm波长处有最大吸收，故选择244 nm作为检测咪喹莫特透皮吸收量的检测波长。

2.3 透皮吸收试验方法

采用Franz扩散池与YB-P6智能透皮试验仪。从冰箱中取出离体猪皮，在室温下化冻，固定于扩散池的给药室与接收室之间，内径1.8 cm，接收室容积约17 ml，磁转子转速300 r/min。扩散池一端用离体猪皮覆盖，使皮肤表层面向给药室，真皮一侧与接收液接触。精密称取咪喹莫特乳膏1.0 g，置给药室中涂抹均匀，并与皮肤密切接触。经预试验结果选定咪喹莫特透皮吸收的接收液为20%PEG400生理氯化钠溶液（取20 ml PEG400，加生理氯化钠溶液稀释至100 ml），水浴温度为37 ℃。在水浴温度达到预置温度时开始计时，分别于1、2、4、6、8、12、24 h取接收室中的接收液1 ml，同时立即向接收室中补充等体积同温度的接收液。

2.4 色谱条件

色谱柱：Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液-85%磷酸（48∶52∶0.2，V/V/V），流速：1.0 ml/min；柱温：室温；检测波长：244 nm；进样量：50 μl。

2.5 空白辅料的干扰试验

取离体猪皮，均匀地涂铺空白乳膏1.0 g，置透皮吸收试验装置中，以20%PEG400生理氯化钠溶液17 ml作为接收液，于24 h取样1 ml，精密量取空白乳膏接收液50 μl注入液相色谱仪，记录色谱；另取咪喹莫特对照品溶液及24 h的透皮吸收供试品溶液，分别进样，记录色谱。色谱图见图1。

图1 反相高效液相色谱图A.空白乳膏；B.对照品；C.供试品；1.咪喹莫特Fig 1 RP-HPLC chromatogramsA.blank excipients；B.substance control；C.test sample；1.imiquimod

由图1可见，咪喹莫特主峰的出峰时间约为6.5 min，空白乳膏在咪喹莫特主峰处无色谱峰出现，即空白乳膏对透皮接收液中咪喹莫特透皮吸收量的测定无干扰。供试品溶液中咪喹莫特主峰后有1个峰，二者分离度为2.62，符合《中国药典》相关要求，说明空白辅料对咪喹莫特的测定无干扰。

2.6 检测限与定量限考察

取咪喹莫特对照品适量，加适量甲醇溶解后，用20%PEG400生理氯化钠溶液配制成一定浓度的稀溶液，按信噪比为3和10分别测定检测限及定量限。结果咪喹莫特的检测限为0.05 ng，定量限为0.15 ng。

2.7 线性关系考察

取咪喹莫特对照品约10 mg，精密称定，置于100 ml量瓶中，加0.1 mol/L盐酸溶液溶解后，定容，摇匀。精密量取5 ml，置于50 ml量瓶中，加20%PEG400生理氯化钠溶液稀释至刻度，摇匀，再精密量取0.5、1.0、2.0 ml，分别置于10 ml量瓶中，加20%PEG400生理氯化钠溶液稀释至刻度，摇匀，制成0.5、1.0、2.0 µg/ml的溶液。精密量取0.5 µg/ml的溶液适量，用20%PEG400生理氯化钠溶液稀释并制成0.01、0.05、0.1µg/ml的溶液，精密量取上述6种质量浓度的溶液各50 μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱。以质量浓度（c）为横坐标、峰面积（A）为纵坐标进行线性回归分析，得回归方程为A＝3.052 2×103+2.302 9×105c（r＝0.999 2，n＝6）。结果表明，咪喹莫特在20%PEG400生理氯化钠溶液中检测质量浓度的线性范围为0.01～2.0 μg/ml。

2.8 进样精密度试验

取“2.7”项下质量浓度为0.5µg/ml的咪喹莫特对照品溶液50 μl，重复进样5次，记录峰面积。结果峰面积的RSD为1.3%（n＝5），表明仪器进样精密度良好。

2.9 溶液稳定性试验

取咪喹莫特对照品适量，加0.1 mol/L盐酸溶液溶解后，用空白乳膏24 h的皮肤接收液稀释并制成质量浓度为0.2µg/ml的供试品溶液，室温放置0、2、4、6、8、12、24 h后，各精密量取50 μl，分别注入液相色谱仪，记录峰面积，考察咪喹莫特在透皮接收液中的稳定性。结果峰面积的RSD为0.45%（n＝7），表明咪喹莫特在透皮接收液中24 h内稳定。

2.10 回收率试验

取咪喹莫特对照品约10 mg，精密称定，置于100 ml量瓶中，加0.1 mol/L盐酸溶液溶解后，精密量取5 ml，置于50 ml量瓶中，加空白乳膏24 h的皮肤接收液稀释至刻度，摇匀，制成咪喹莫特质量浓度分别为0.05、0.1、1µg/ml的供试品溶液。各取50 μl上述供试品溶液分别注入液相色谱仪，记录峰面积，代入回归方程计算浓度和回收率。结果低、中、高质量浓度的回收率分别为98.67%（RSD＝2.6%）、99.65%（RSD＝0.63%）、99.36%（RSD＝0.41%），平均回收率为99.23%（RSD＝0.51%，n＝3），表明咪喹莫特在透皮接收液中测定的准确度较好。

2.11 样品体外透皮率考察

精密量取“2.2”项下透皮接收液50 μl注入液相色谱仪，记录峰面积，代入回归方程计算各取样点的咪喹莫特浓度，并按下列公式计算单位面积累积透皮量（Q）和稳态渗透速率常数（Js）。Q＝（cnV+∑ciVi）/A[2]，式中cn为各取样时间点样品中咪喹莫特的质量浓度，V为接收室体积，ci为各取样时间点前次取样液中咪喹莫特的质量浓度，Vi为取样体积，A为扩散池面积。以Q对渗透时间t进行线性回归分析，所得斜率即为Js。根据以上Q值，即可计算出咪喹莫特乳膏的累积渗皮率＝Q/W×100%[2]，式中W为取样的样品中所含主药咪喹莫特的质量。3批样品与进口对照药的体外透皮结果见表1，累积透皮率-时间曲线见图2。

表1 咪喹莫特乳膏体外透皮结果Tab 1 Transdermal permeation of Imiquimod cream

由表1和图2结果可知，咪喹莫特乳膏3批样品与进口对照药的透皮吸收情况基本一致，24 h的累积透皮率平均值均小于0.1%，故可认为咪喹莫特乳膏作为外用皮肤药，仅为局部作用而非全身吸收作用。

3 讨论

图2 咪喹莫特乳膏的累积透皮率-时间曲线Fig 2 Accumulative penetration rate-time curve of Imiquimod cream

据相关文献报道，透皮吸收常用的实验动物主要有小鼠、豚鼠、大鼠、猪、家兔及蛇[3]；刚断奶的乳猪与人体皮肤层次结构和渗透性最接近，是理想的皮肤模型[4]；特别是刚断奶的猪背皮肤与人的前臂皮肤最接近，且小型猪的皮肤与人的穿透性特征最接近[5]。

皮肤外用药物进行透皮吸收试验，其接收液主要采用生理氯化钠溶液、30%乙醇-生理氯化钠溶液、聚乙二醇-生理氯化钠溶液（20∶80）、pH 6.8及pH 7.4的磷酸盐缓冲液、10%聚山梨酯80的生理氯化钠溶液等[6-7]。但笔者前期经溶解度试验发现，咪喹莫特几乎不溶于生理氯化钠溶液、30%乙醇-生理氯化钠溶液和pH 6.8的磷酸盐缓冲液。故笔者参照文献[8-9]，采用20%PEG400生理氯化钠溶液作为透皮接收液，发现可达到药物溶出介质所需的漏槽条件，结果可靠。

本试验建立了RP-HPLC法检测咪喹莫特乳膏体外透皮量的方法，该方法快速、灵敏、准确、可靠，为外用制剂的体外透皮吸收提供了一个较好的研究方法。

[1]许岚.免疫调节剂咪喹莫特乳膏在皮肤科的临床应用进展[J].中国药房，2009，20（2）：150.

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[3]罗世英，陈华萍.透皮吸收常用的几种实验动物[J].中国药业，2004，13（4）：74.

[4]毛宗珍，胡亚婷，郑英.噻酮对离体乳猪皮肤光透明效果影响的实验研究[J].光学学报，2007，27（3）：526.

[5]柳朋生，郑家润.用猪作人透皮实验动物模型的有关资料[J].国外医学皮肤性病学分册，2001，27（4）：243.

[6]魏敏，周莉玲，黄春青，等.以主药溶解性能筛选体外经皮渗透试验中的接收液[J].中药材，2005，28（4）：332.

[7]周莉玲，侯海霞，李锐.青蒿琥酯透皮吸收研究中接收液的筛选[J].中成药，2000，22（3）：184.

[8]倪倩，丁虹，刘洁，等.咪喹莫特固体脂质纳米粒的制备及体外透皮作用[J].中国医药工业杂志，2006，37（8）：537.

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