洋葱atp6基因的克隆与系统进化分析
2015-03-09王振宝等
王振宝等
摘要：细胞质雄性不育（CMS）在作物遗传育种研究中占有重要地位，多种植物的细胞质雄性不育均与线粒体基因结构变异及新嵌合基因的产生有关。为探索线粒体atp6基因与洋葱CMS的关系，以13份不育系和11份保持系为材料克隆洋葱atp6基因编码序列，测序结果表明不同材料atp6基因间存在一个C/A多态性位点，该多态性位点在不育系和保持系间随机出现，而不是不育系与保持系的特征差异。蛋白质分析表明这一多态性位点的变异并未改变atp6蛋白跨膜结构。进一步的蛋白比对分析揭示了atp6蛋白在物种间有一定的保守性，特别是第IV跨膜结构域的Arg在所有物种中是高度保守的，也是H+转运所必需的。基于atp6蛋白序列的系统进化树显示细菌和病毒位于树的基部，其次是真菌、低等藻类以及原生生物，然后高等藻类、苔藓和蕨类，高等绿色开花植物处于树的顶端，单子叶植物处于树的最顶端。
关键词：洋葱；雄性不育；atp6基因；系统进化
中图分类号：Q785文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）01-0010-05
洋葱（AlliumcepaL.）又名玉葱、圆葱、葱头等，起源于亚洲西部，属于百合科葱蒜属二年生蔬菜，广泛种植于世界各地。洋葱于近代传入我国，由于具有适应性强、耐贮藏和运输的特点，发展迅速。洋葱是类黄酮的重要食物来源之一，对人体的健康有很大的影响，它具有广泛的生物活性和重要的药用价值，在防止心血管疾病、抗肿瘤、抗自由基、抗氧化、抗过敏、消炎、抗病毒等方面有重要作用[1]。
洋葱是最早利用雄性不育系育种的蔬菜作物之一，雄性不育的产生通常是由于线粒体基因的插入、缺失、重排等造成的基因突变以及形成新的嵌合基因[2]。在以往的研究中，此类基因主要为能量代谢相关蛋白（ATP、Cob、Cox和NAD/NADP）基因[3]。atp6基因是重要的线粒体功能基因，编码F1F0-ATP合成酶系统中F0部分最大亚基——A亚基[4]。目前已知水稻、油菜、萝卜、大豆的雄性不育与atp6基因的突变有关[5～8]。前人的研究表明，在S（Sterile）型细胞质与N/T（Normal）型细胞质之间，atp6基因的编码序列存在一个碱基的突变[9，10]，该突变是否是导致雄性不育的原因目前尚无定论。本研究克隆了洋葱13个不育系与11个保持系的atp6基因，对其核酸和编码蛋白序列进行了生物信息学及进化树分析，以期通过单倍型的分布和蛋白质结构分析，探究atp6基因是否是导致洋葱雄性不育的直接原因。
1材料与方法
1.1试验材料
以13份雄性不育系（110，118，502，503，101，117-5，117-11-1，117-10-1，117-10-2，117-10-3，L701，L702和L703）和11份保持系（210，218，602，603，202，217-5，217-11-1，217-10-1，217-10-2，217-10-3和L801）为材料进行基因克隆[11]。洋葱新鲜叶片采自山东省农业科学院蔬菜研究所试验基地，取样后迅速放入液氮中冷冻，于-80°C保存备用。
1.2洋葱基因组总DNA的提取
洋葱基因组总DNA的提取采用快捷型植物基因组DNA提取试剂盒（Tiangen，北京），方法参照操作说明书。
1.3洋葱atp6基因克隆
本研究所用的上游引物P1：5′-ATGAGTGCTGAAAGTAGGAAAGAGTA-3′，下游引物P2：5′-TCAATGTTGATATGACTCATTTTGATG-3′，由上海生工生物工程股份有限公司合成。
PCR反应总体积为25μl，其中模板（基因组DNA）1μl，2.5mmol/LdNTPs4μl，10×LATaqbuffer2.5μl，引物各1μl，TaKaRaLATaq0.25μl，用灭菌蒸馏水补齐至25μl。扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃保温10min，4℃保存。
PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像系统上检测并拍照记录。目的条带用凝胶回收试剂盒（Tiangen，北京）回收，与克隆载体pMD18-T（宝生物，大连）连接，转化大肠杆菌（Escherichiacoli）DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选、菌液PCR鉴定后，将阳性克隆送博尚生物技术有限公司进行测序。
1.4序列分析
利用DNAMAN和Blast（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi）进行序列比对；SOPMA（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）、TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）用于蛋白质的二级结构分析；MEGA5用于系统进化树分析。
2结果与分析
2.1洋葱atp6基因的克隆与序列特征
PCR扩增产物电泳结果（图1）显示，扩增片段大小约为800bp，与预期片段大小相吻合。将阳性克隆进行序列测定及分析后发现，24个洋葱育种系的atp6基因间存在一个多态性位点C/A，且该多态性位点在不育系内、保持系内以及不育系和保持系间均随机出现（表1）。这一结果表明，C/A多态性位点的突变并不是不育系或者保持系所特有的共性突变。
洋葱atp6基因编码蛋白序列与已报道其他物种同源序列相似度从40%到90%不等，相似度最高的物种为海枣（Phoenixdactylifera），最低的为印度洋大洋杆菌（Oceanibaculumindicum）。其中第IV跨膜结构域的Arg在所有物种中是高度保守的，也是H+转运所必需的。
为进一步了解atp6蛋白的进化、分类以及作为系统进化研究材料的可能性，对101条来自不同物种的atp6蛋白序列进行序列联配，并用ML法构建系统进化树，进化树直观地显示了高等绿色植物、藻类、真菌、细菌和病毒之间的亲缘关系（图3）。细菌和病毒位于树的基部，其次是真菌、原生生物以及绿藻，然后是高等植物。在高等绿色开花植物分支内部，所有的双子叶植物均处于一个大的分支上，单子叶植物存在多个分支，且单子叶植物处于树的最顶端。
3结论与讨论
本试验以13份雄性不育系和11份保持系为材料克隆了洋葱atp6基因，序列分析表明，不同材料的洋葱atp6基因在92bp处存在一个多态性位点C/A，这个多态性位点在不育系内、保持系内以及不育系和保持系之间随机出现。该多态性位点碱基的突变（C-A）使得第31位Ser突变为Tyr，然而第一跨膜结构域起始位点为第34位，并未引起atp6跨膜结构域的变化，说明洋葱atp6基因在该多态性位点的变异，并不是造成洋葱细胞质雄性不育的直接原因。
系统进化树分析表明，atp6基因编码蛋白在整体上是根据物种类型聚类的，可以明显的划分为四类，细菌和病毒，真菌、低等藻类和原生生物，高等藻类、苔藓和蕨类，及高等绿色开花植物。细菌和病毒位于树的基部，说明其在进化地位上是最原始的类型，其次是真菌、原生生物以及低等藻类，然后是高等藻类、苔藓和蕨类，高等植物处于树的顶端，且单子叶植物处于树的最顶端，这个结果符合生物起源与进化的关系[12]。系统进化树的分析结果也支持高等绿色植物和现代藻类均与Mesostigmaviride（原始绿藻）具有共同祖先的观点[13]。在高等绿色开花植物分支内部，单子叶植物的洋葱、海枣和双子叶植物处于一个分支，单子叶植物内部也存在多个不同起源，这说明在单、双子叶植物分化以前atp6基因已经产生了分化，或者是单、双子叶植物存在不同的起源[12]，因此，atp6基因在一定程度上能够反映物种进化的先后顺序，但atp6基因的进化与物种的进化并不是完全同时发生的。
参考文献：
[1]霍凤梅，缪军，吴雄，等.洋葱查尔酮合成酶基因的分子克隆和表达分析[J].山东农业科学，2010，5：1-4.
[2]DragoevaA，AtanassovI.CMSduetotapetalfailureincybridsbetweenNicotianatabacunandPetuniahybrida[J].PlantCellTissueOrganCulture，2001，55：67-70.
[3]HansonMR，BentolilaS.Interactionsofmitochondrialandnucleargenesthataffectmalegametophytedevelopment[J].ThePlantCell，2004，16（S）：154-169.
[4]JiJ，HuangW，YinC，etal.MitochondrialcytochromecoxidaseandF1Fo-ATPasedysfunctioninpeppers（CapsicumannuumL.）withcytoplasmicmalesterilityanditsassociationwithorf507andatp6-2genes[J].InternationalJournalofMolecularSciences，2013，14（1）：1050-1068.
[5]KadowakiK，SuzukiT，KazamaS.Achimericgenecontainingthe5′portionofatp6isassociatedwithcytoplasmicmale-sterilityofrice[J].MolecularGeneticsandGenomics，1990，224（1）：10-16.
[6]MakaroffCA，ApelIJ，PalmerJD.Theatp6codingregionhasbeendisruptedandnovelreadingframegeneratedinthemitochondrialgenomeofcytoplasmicmale-sterileradish[J].JournalofBiologicalChemistry，1989，264（20）：11706-11713.
[7]LandgrenM，ZetterstrandM，SundbergE，etal.Alloplasmicmale-sterileBrassicalinescontainingB.tournefortiimitochondriaexpressanORF3′oftheatp6geneanda32kDaprotein[J].PlantMol.Biol.，1996，32（5）：879-890.
[8]韩利涛，杨守萍，喻德跃，等.大豆细胞质雄性不育系与保持系atp6基因的RNA编辑比较研究[J].大豆科学，2010，29（3）：361-365.
[9]赵婷，朱腾义.烟草线粒体基因atp6的SNP及其与CMS的相关性[J].作物学报，2009，35（9）：1655-1661.
[10]周晓娟，赵瑞，王永勤.洋葱异源胞质雄性不育候选基因atp6的克隆与表达分析[J].沈阳农业大学学报，2012，43（2）：148-152.
[11]YangYY，HuoYM，WangZB，etal.IdentificationoftwoSCARmarkersco-segregatedwiththedominantMsandrecessivemsallelesinonion（AlliumcepaL.）[J].Euphytica，2013，190（2）：267-277.
[12]CronquistA.Anintegratedsystemofclassificationoffloweringplants[M].NewYork：ColumbiaUniv.Press，1981.
[13]BhattacharyaD，WeberK，AnSS，etal.ActinphylogenyidentifiesMesostigmavirideasaflagellateancestorofthelandplants[J].MolecularBiologyandEvolution，1998，47（5）：544-553.
为进一步了解atp6蛋白的进化、分类以及作为系统进化研究材料的可能性，对101条来自不同物种的atp6蛋白序列进行序列联配，并用ML法构建系统进化树，进化树直观地显示了高等绿色植物、藻类、真菌、细菌和病毒之间的亲缘关系（图3）。细菌和病毒位于树的基部，其次是真菌、原生生物以及绿藻，然后是高等植物。在高等绿色开花植物分支内部，所有的双子叶植物均处于一个大的分支上，单子叶植物存在多个分支，且单子叶植物处于树的最顶端。
3结论与讨论
本试验以13份雄性不育系和11份保持系为材料克隆了洋葱atp6基因，序列分析表明，不同材料的洋葱atp6基因在92bp处存在一个多态性位点C/A，这个多态性位点在不育系内、保持系内以及不育系和保持系之间随机出现。该多态性位点碱基的突变（C-A）使得第31位Ser突变为Tyr，然而第一跨膜结构域起始位点为第34位，并未引起atp6跨膜结构域的变化，说明洋葱atp6基因在该多态性位点的变异，并不是造成洋葱细胞质雄性不育的直接原因。
系统进化树分析表明，atp6基因编码蛋白在整体上是根据物种类型聚类的，可以明显的划分为四类，细菌和病毒，真菌、低等藻类和原生生物，高等藻类、苔藓和蕨类，及高等绿色开花植物。细菌和病毒位于树的基部，说明其在进化地位上是最原始的类型，其次是真菌、原生生物以及低等藻类，然后是高等藻类、苔藓和蕨类，高等植物处于树的顶端，且单子叶植物处于树的最顶端，这个结果符合生物起源与进化的关系[12]。系统进化树的分析结果也支持高等绿色植物和现代藻类均与Mesostigmaviride（原始绿藻）具有共同祖先的观点[13]。在高等绿色开花植物分支内部，单子叶植物的洋葱、海枣和双子叶植物处于一个分支，单子叶植物内部也存在多个不同起源，这说明在单、双子叶植物分化以前atp6基因已经产生了分化，或者是单、双子叶植物存在不同的起源[12]，因此，atp6基因在一定程度上能够反映物种进化的先后顺序，但atp6基因的进化与物种的进化并不是完全同时发生的。
参考文献：
[1]霍凤梅，缪军，吴雄，等.洋葱查尔酮合成酶基因的分子克隆和表达分析[J].山东农业科学，2010，5：1-4.
[2]DragoevaA，AtanassovI.CMSduetotapetalfailureincybridsbetweenNicotianatabacunandPetuniahybrida[J].PlantCellTissueOrganCulture，2001，55：67-70.
[3]HansonMR，BentolilaS.Interactionsofmitochondrialandnucleargenesthataffectmalegametophytedevelopment[J].ThePlantCell，2004，16（S）：154-169.
[4]JiJ，HuangW，YinC，etal.MitochondrialcytochromecoxidaseandF1Fo-ATPasedysfunctioninpeppers（CapsicumannuumL.）withcytoplasmicmalesterilityanditsassociationwithorf507andatp6-2genes[J].InternationalJournalofMolecularSciences，2013，14（1）：1050-1068.
[5]KadowakiK，SuzukiT，KazamaS.Achimericgenecontainingthe5′portionofatp6isassociatedwithcytoplasmicmale-sterilityofrice[J].MolecularGeneticsandGenomics，1990，224（1）：10-16.
[6]MakaroffCA，ApelIJ，PalmerJD.Theatp6codingregionhasbeendisruptedandnovelreadingframegeneratedinthemitochondrialgenomeofcytoplasmicmale-sterileradish[J].JournalofBiologicalChemistry，1989，264（20）：11706-11713.
[7]LandgrenM，ZetterstrandM，SundbergE，etal.Alloplasmicmale-sterileBrassicalinescontainingB.tournefortiimitochondriaexpressanORF3′oftheatp6geneanda32kDaprotein[J].PlantMol.Biol.，1996，32（5）：879-890.
[8]韩利涛，杨守萍，喻德跃，等.大豆细胞质雄性不育系与保持系atp6基因的RNA编辑比较研究[J].大豆科学，2010，29（3）：361-365.
[9]赵婷，朱腾义.烟草线粒体基因atp6的SNP及其与CMS的相关性[J].作物学报，2009，35（9）：1655-1661.
[10]周晓娟，赵瑞，王永勤.洋葱异源胞质雄性不育候选基因atp6的克隆与表达分析[J].沈阳农业大学学报，2012，43（2）：148-152.
[11]YangYY，HuoYM，WangZB，etal.IdentificationoftwoSCARmarkersco-segregatedwiththedominantMsandrecessivemsallelesinonion（AlliumcepaL.）[J].Euphytica，2013，190（2）：267-277.
[12]CronquistA.Anintegratedsystemofclassificationoffloweringplants[M].NewYork：ColumbiaUniv.Press，1981.
[13]BhattacharyaD，WeberK，AnSS，etal.ActinphylogenyidentifiesMesostigmavirideasaflagellateancestorofthelandplants[J].MolecularBiologyandEvolution，1998，47（5）：544-553.
为进一步了解atp6蛋白的进化、分类以及作为系统进化研究材料的可能性，对101条来自不同物种的atp6蛋白序列进行序列联配，并用ML法构建系统进化树，进化树直观地显示了高等绿色植物、藻类、真菌、细菌和病毒之间的亲缘关系（图3）。细菌和病毒位于树的基部，其次是真菌、原生生物以及绿藻，然后是高等植物。在高等绿色开花植物分支内部，所有的双子叶植物均处于一个大的分支上，单子叶植物存在多个分支，且单子叶植物处于树的最顶端。
3结论与讨论
本试验以13份雄性不育系和11份保持系为材料克隆了洋葱atp6基因，序列分析表明，不同材料的洋葱atp6基因在92bp处存在一个多态性位点C/A，这个多态性位点在不育系内、保持系内以及不育系和保持系之间随机出现。该多态性位点碱基的突变（C-A）使得第31位Ser突变为Tyr，然而第一跨膜结构域起始位点为第34位，并未引起atp6跨膜结构域的变化，说明洋葱atp6基因在该多态性位点的变异，并不是造成洋葱细胞质雄性不育的直接原因。
系统进化树分析表明，atp6基因编码蛋白在整体上是根据物种类型聚类的，可以明显的划分为四类，细菌和病毒，真菌、低等藻类和原生生物，高等藻类、苔藓和蕨类，及高等绿色开花植物。细菌和病毒位于树的基部，说明其在进化地位上是最原始的类型，其次是真菌、原生生物以及低等藻类，然后是高等藻类、苔藓和蕨类，高等植物处于树的顶端，且单子叶植物处于树的最顶端，这个结果符合生物起源与进化的关系[12]。系统进化树的分析结果也支持高等绿色植物和现代藻类均与Mesostigmaviride（原始绿藻）具有共同祖先的观点[13]。在高等绿色开花植物分支内部，单子叶植物的洋葱、海枣和双子叶植物处于一个分支，单子叶植物内部也存在多个不同起源，这说明在单、双子叶植物分化以前atp6基因已经产生了分化，或者是单、双子叶植物存在不同的起源[12]，因此，atp6基因在一定程度上能够反映物种进化的先后顺序，但atp6基因的进化与物种的进化并不是完全同时发生的。
参考文献：
[1]霍凤梅，缪军，吴雄，等.洋葱查尔酮合成酶基因的分子克隆和表达分析[J].山东农业科学，2010，5：1-4.
[2]DragoevaA，AtanassovI.CMSduetotapetalfailureincybridsbetweenNicotianatabacunandPetuniahybrida[J].PlantCellTissueOrganCulture，2001，55：67-70.
[3]HansonMR，BentolilaS.Interactionsofmitochondrialandnucleargenesthataffectmalegametophytedevelopment[J].ThePlantCell，2004，16（S）：154-169.
[4]JiJ，HuangW，YinC，etal.MitochondrialcytochromecoxidaseandF1Fo-ATPasedysfunctioninpeppers（CapsicumannuumL.）withcytoplasmicmalesterilityanditsassociationwithorf507andatp6-2genes[J].InternationalJournalofMolecularSciences，2013，14（1）：1050-1068.
[5]KadowakiK，SuzukiT，KazamaS.Achimericgenecontainingthe5′portionofatp6isassociatedwithcytoplasmicmale-sterilityofrice[J].MolecularGeneticsandGenomics，1990，224（1）：10-16.
[6]MakaroffCA，ApelIJ，PalmerJD.Theatp6codingregionhasbeendisruptedandnovelreadingframegeneratedinthemitochondrialgenomeofcytoplasmicmale-sterileradish[J].JournalofBiologicalChemistry，1989，264（20）：11706-11713.
[7]LandgrenM，ZetterstrandM，SundbergE，etal.Alloplasmicmale-sterileBrassicalinescontainingB.tournefortiimitochondriaexpressanORF3′oftheatp6geneanda32kDaprotein[J].PlantMol.Biol.，1996，32（5）：879-890.
[8]韩利涛，杨守萍，喻德跃，等.大豆细胞质雄性不育系与保持系atp6基因的RNA编辑比较研究[J].大豆科学，2010，29（3）：361-365.
[9]赵婷，朱腾义.烟草线粒体基因atp6的SNP及其与CMS的相关性[J].作物学报，2009，35（9）：1655-1661.
[10]周晓娟，赵瑞，王永勤.洋葱异源胞质雄性不育候选基因atp6的克隆与表达分析[J].沈阳农业大学学报，2012，43（2）：148-152.
[11]YangYY，HuoYM，WangZB，etal.IdentificationoftwoSCARmarkersco-segregatedwiththedominantMsandrecessivemsallelesinonion（AlliumcepaL.）[J].Euphytica，2013，190（2）：267-277.
[12]CronquistA.Anintegratedsystemofclassificationoffloweringplants[M].NewYork：ColumbiaUniv.Press，1981.
[13]BhattacharyaD，WeberK，AnSS，etal.ActinphylogenyidentifiesMesostigmavirideasaflagellateancestorofthelandplants[J].MolecularBiologyandEvolution，1998，47（5）：544-553.
