刘胜男 刘志华 王玉成

(林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学)，哈尔滨，150040)

责任编辑:潘 华。

目前，在世界各地，盐碱、干旱和低温等逆境条件严重影响植物的生长和作物的产量，及人类的生活环境和粮食安全。因此，研究植物抗逆机理对植物生长具有重要意义。随着分子生物学的不断发展，已有大量研究表明转录因子在植物逆境信号传递过程中起着非常重要的作用，它通过调控植物体内特定功能基因的表达，来应答逆境胁迫［1］。因此，对相关转录因子蛋白功能的研究是解决植物抗逆的关键所在。

在真核生物中，转录因子，也被称为反式作用因子，通过与真核生物基因启动子中的顺式作用元件特异性结合，从而对转录过程起到激活或抑制作用［2］。Riechmann 和Jakboy 等人研究发现，碱性区域亮氨酸拉链蛋白，即bZIP(Basic region/leucine －zipper motif)类转录因子，是真核生物转录因子中分布最为广泛且最为保守的一类蛋白，在人类、动物、植物和微生物中均有报道［3－4］。研究发现，bZIP 类转录因子广泛参与植物生长发育、种子储藏、种子成熟、衰老、光信号转导、损伤修复和病菌防御等多种生物学过程［5－14］。bZIP 类转录因子识别的核心序列为 AGTC 顺式作用元件，其中包括 G 盒(CACGTG)、C 盒(GACGTC)、A 盒(TACGTA)，一些受光、脱落酸(ABA)诱导的基因的启动子区都含有这些元件［15］。转bZIP 基因的植株在高盐、干旱、低温和高温逆境条件下都表现出明显的生长优势［16］。目前，已从拟南芥、烟草、水稻等大量草本植物中分离获得bZIP 类转录因子［17］，但木本植物中bZIP 类转录因子功能的研究报道较少。

柽柳是一种具有极强抗逆能力的木本植物。徐晨曦等人［18］对柽柳TaelF5A 基因抗逆功能研究发现，该基因对盐碱、干旱、过氧化物及重金属在内的多种胁迫具有抵抗能力;李红艳等［19］研究发现柽柳lea 和MnSOD 基因具有抗盐、抗旱能力。目前已有研究表明，柽柳中ERF 乙烯响应因子、WRKY 转录因子及bZIP 转录因子具有抗逆能力［15，20－21］。

为了进一步对柽柳中抗逆相关转录因子蛋白活性分析，抗体制备及蛋白与特定元件结合验证等试验的研究，获得纯化的重组蛋白已成为关键性问题;而目前已有的植物蛋白提取方法很难对专一性蛋白进行提取，尤其对木本植物而言。突破以往原核表达技术在微生物及草本植物专一性蛋白获取实验中的应用，本实验通过克隆柽柳中ThbZIP1 转录因子基因，并将其构建到原核表达载体pGEX －4T －2 中，利用IPTG 诱导并纯化重组蛋白，从而获得了柽柳bZIP1转录因子蛋白。获取的专一性bZIP1 转录因子蛋白为柽柳bZIP1 转录因子的抗逆功能研究提供了抗体制备的纯化重组蛋白，也为对柽柳中bZIP1 转录因子蛋白活性分析及其与特定元件结合验证试验提供了前提保障。同时本实验的研究方法也为木本植物专一性蛋白的获取拓宽了研究思路，提供了方法借鉴。

1 材料与方法

柽柳(Tamarix hispida)由新疆吐鲁番沙漠植物园提供;Top10 大肠杆菌感受态细胞购自北京盖宁生物公司;原核表达载体pGEX －4T －2 购自GE Healthcare 公司;Ex Taq、RNA 反转录试剂盒等购自TaKaRa 公司;BamHI，SalI 和T4 DNA ligase 等购自Promaga 公司;质粒(小量)提取试剂盒、胶回收试剂盒、PCR 产物纯化试剂盒均购自OMEGA 公司;其它试剂均购自哈尔滨伊士达生物公司。

1.1 柽柳总RNA 的提取

将扦插3～4 周大的组培柽柳苗用液氮速冻、充分研磨，利用CTAB 法［22］提取柽柳总RNA，并用DNase I 进行处理。利用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测RNA 浓度。

1.2 ThbZIP1 基因的扩增

根据ThbZIP1 的基因序列设计引物，并在其上游和下游分别引入BamHI 和SalI 的酶切位点，引物序列 为，bZIP1 － F:5’－ TCGGGATCCATGTATCAACCCGTGAGTTC － 3’;bZIP1 － R:5’－ CGATGTCGACCCGAACTGAAACATATCAGCGGT － 3’;其中酶切位点用下划线表示。以提取的柽柳总RNA反转录的cDNA 为模板，PCR 扩增ThbZIP1 基因;反应体系为:RT 产物200 ng，10 ×Ex Taq buffer 2 μL，bZIP1 －F 引物1 μL，bZIP1 －R 引物1 μL，dNTP 0.4 μL，Ex Taq DNA 聚合酶0.3 μL，去离子水补至20 μL。反应程序:94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，32 个循环，72 ℃复性7 min。PCR 产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，并回收目的片段。

1.3 序列分析

利用ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)网站查找ThbZIP1 基因的开放读码框序列;利用Expasy(http://web.expasy.org/cgi－bin/protparam/protparam)在线查找ThbZIP1 基因的分子量和等电点;利用Clustalx1 8.3 软件进行多序列比对，利用MEGA5.1 软件构建系统进化树。

1.4 表达载体的构建

将回收的目的片段和pGEX－4T－2 质粒，分别用BamHI 和SalI 进行双酶切，回收酶切产物，T4 DNA 连接酶将ThbZIP1 基因与pGEX －4T －2 质粒16 ℃过夜连接，并将连接产物转化Top10 大肠杆菌感受态细胞，37 ℃过夜培养后，挑取单斑菌液PCR检测，挑取单克隆提取质粒送交上海生工(http://www.sangon.com/sangon)测序。提取阳性克隆质粒，转化宿主菌BL21 中。经菌液PCR 检测后确定的阳性克隆保存菌种备用。

1.5 重组蛋白的诱导表达

分别在16、30、37 ℃条件下挑取已鉴定的阳性克隆，在10 mL 含有50 μg/mL 羧苄青霉素的LB 液体培养基中180 r/min 震荡培养。在OD600为1.7时，IPTG 分别诱导4 h，收集2 mL 菌液，将收集的菌体4 ℃，12 000 r/min 离心5 min。弃上清，向沉淀中加入200 μL 大肠杆菌蛋白提取液，并在蛋白提取30、40、50、60 min 4 个时间点收集提取液，在4 ℃条件下，12 000 r/min 离心15～20 min，分离沉淀和上清，10% SDS－PAGE 检测。

1.6 重组蛋白的纯化

取一段6～8 cm 透析袋，在沸水中煮沸10 min后浸泡于50%乙醇溶液10 min，然后用EDTA 溶液和蒸馏水依次冲洗1 次。将脱色后的目的蛋白用刀片切割回收，切割下来的目的蛋白胶粒置于备好的透析袋中同时向透析袋中加入Tris － glycine 溶液(pH=8.13)，封好透析袋后，放入预冷的Tris －glycine 溶液(pH=8.13)的电泳槽中，100 V，电泳透析4 h;每30 min 搅动透析袋待考马斯亮蓝完全从胶粒上脱离下来时倒转电源，电泳5 min，停止电泳;将透析袋置于4 ℃的100 mm PBS 溶液中，过夜处理，期间要缓慢搅动。透析结束后取出透析袋里的液体，并加入等体积的预冷丙酮，于4 ℃静置1 h，14 000 r/min，离心30 min。沉淀用适量的10 mm PBS 溶液溶解，10% SDS－PAGE 电泳检测。

2 结果与分析

2.1 ThbZIP1 基因的扩增和序列分析

以柽柳总RNA 反转录的cDNA 为模板，扩增片段长度为435 bp，与目的片段长度相符(如图1)。生物信息学分析表明，ThbZIP1 基因(GenBank 登录号为:FJ752700)ORF 序列长435 bp，共编码144 个氨基酸，分子量为16.5 kDa，等电点为6.60。通过BlastP 进行保守区预测预测结果表明，ThbZIP1 转录因子蛋白保守区从第20 位的氨基酸开始，到80 位的氨基酸结束(如图2)。在NCBI 数据库中进行多序列比对分析，结果表明这些氨基酸序列N 末端有一段高保守序列(图3中黑色背景部分)，即大概由20 个左右的亮氨酸组成的亮氨酸拉链(Leucine Zipper)LZ 区域;能够参与寡聚化作用LZ 区域与碱性区域(Basic region)紧密相连，并且每7 个氨基酸的第7 位含有一个亮氨酸［16］。柽柳bZIP1 保守区域可以与专一的DNA 序列进行相互作用，该区域对于bZIP1 转录因子蛋白的功能具有重要作用(如图3)。利用MEGA5.1，将ThbZIP1 基因编码的氨基酸序列与基因库中毛果杨(Populus trichocarpa，XP －002301511 和XP －002306888)、大豆(Glycine max，NP － 001237222.1 和AB134674)、小 麦(Triticum aestivum，BAF99134)、拟南芥(Arabidopsis thaliana，XP－002301511)、烟草(Nicotiana tabacum，AAK92214)、木氏 烟(Nicotiana benthamiana，CBM56257)、苹果(Malus domestica，ADL36616)、可可(Theobroma cacao，XP－007042116)和甜椒(Capsicum annuum，ABB17073)构建系统进化树。分析表明，ThbZIP1 基因编码的蛋白与木氏烟的bZIP 蛋白亲缘关系最近，与小麦的bZIP 蛋白亲缘关系最远(图4)。

图1 柽柳总RNA 及bZIP1 基因PCR 扩增产物电泳

图2 ThbZIP1 转录因子蛋白保守区预测

图3 柽柳ThbZIP1 与其它植物bZIP 转录因子氨基酸序列多序列比对，其中黑色背景为高度保守序列

2.2 柽柳ThbZIP1 基因表达载体的构建

将引物bZIP1 －F 和bZIP1 －R 扩增得到的目的片段用BamHI 和SalI 酶切回收后与酶切线性化载体pGEX－4T －2 连接，经菌液PCR 产物电泳检查条带与目的条带位置一致(如图5)，提取质粒再次测序，测序结果表明，测序序列与目的条带序列比对完全。分析表明:ThbZIP1 基因的表达载体pGEXThbZIP1 构建成功。

2.3 ThbZIP1 转录因子蛋白在原核系统中的表达

构建的BL21 －ThbZIP1 阳性克隆菌液OD600达到1.7 左右时，用浓度为1.0 mmol/L IPTG 分别在16、30、37 ℃条件下，诱导4 h 后，收集2 mL 菌液，并分别在用大肠杆菌蛋白提取液处理30、40、50、60 min 4 个时间点收集提取液，SDS －PAGE 检测结果表明，在沉淀样品45 kDa 下方的位置处有明显增粗的条带，ThbZIP1 转录因子分子量为16.5 kDa，加上表达标签大小为26 kDa，目的蛋白大小约为42.5 kDa，与预期相符;对照菌株BL21 － pGEX 及未经IPTG 诱导的重组菌株BL21 －ThbZIP1 未见目的条带，说明重组蛋白rThbZIP1 主要以包涵体形式存在(如图6)。同时，电泳结果表明，诱导温度为37 ℃时，大肠杆菌蛋白提取液提取时间为50 min 时，所获目的蛋白量最大，占总蛋白76.42%(如图7)。

图4 柽柳ThbZIP1 转录因子氨基酸序列系统进化树

图5 重组载体pGEX－ThbZIP1 转化后菌液PCR 检测

图6 重组蛋白rThbZIP1SDS－PAGE 电泳检测

图7 不同诱导温度与不同蛋白提取时间下柽柳重组蛋白rThbZIP1 SDS－PAGE 电泳检测

2.4 电纯化法纯化目的蛋白rThbZIP1

通过对重组蛋白条带回收，电纯化法纯化重组蛋白，回收液经SDS －PAGE 电泳检测得到纯度较好的单一蛋白条带，无杂带(如图8)。

图8 37 ℃IPTG 诱导后不同蛋白提取时间重组蛋白rThbZIP1 及重组蛋白rThbZIP1 电纯化回收SDS －PAGE 电泳检测

3 结论与讨论

Ji 等人［23］已对柽柳ThbZIP1 转录因子基因的分子抗逆机理做了深入研究，而对ThbZIP1 转录因子蛋白与特定元件的验证试验，如EMSA 等研究还没有报道。臧闻、翟莹等人［24－25］利用原核表达的方法分别获取了小麦“陕253”PDI 基因的重组蛋白和大豆GmERF6 转录因子基因的重组蛋白;草本植物利用该方法获得重组蛋白已有大量文献记载，但木本植物利用该方法获取专一性重组蛋白的报道少之又少。木本植物生长周期较长，利用试剂盒获取专一性植物蛋白较困难，且效率较低。因而，想要快速高效地获取纯化的重组蛋白，最为简便、快速、高效的方法就是利用原核表达系统获取重组蛋白。本实验中，为了确定ThbZIP1 转录因子最适原核表达条件，分别对诱导温度、诱导时间、大肠杆菌蛋白提取液提取时间，以及菌体收集数量等不同参数进行控制变量分析，试验分析发现，菌体收集数量对重组蛋白表达量几乎没有影响，大肠杆菌蛋白提取液提取时间影响也较小，对蛋白表达量影响最大的两个因素为诱导时间和温度(部分试验数据未列出)。本实验是在37 ℃条件下，用浓度为1.0 mmol/L 的IPTG，诱导4 h，大肠杆菌提取液提取50 min，收获的蛋白提取液，经SDS －PAGE 电泳，回收重组蛋白条带进行的后续纯化实验。以上条件是柽柳ThbZIP1转录因子重组蛋白表达量最大，重组蛋白条带最为清晰的表达条件。

目前，蛋白质的纯化方法根据不同的参量有不同的方法。根据蛋白大小不同，分为透析，超滤，离心和凝胶过滤等;根据溶解度不同分离纯化蛋白的方法分为等电点沉淀和pH 值调节，蛋白质的盐析和盐溶，有机溶剂分级分离法，双水相萃取法和反胶团萃取法;根据电荷不同分离纯化蛋白的方法包括电泳和离子层析法;利用选择性吸附的分离纯化方法包括羟磷石灰层析和疏水作用层析;利用配体的特异生物学亲和力的纯化方法包括凝集素亲和层析，免疫亲和层析，金属螯合层析，染料配体层析和共价层析等方法;有研究分析发现，还有高效液相层析和快速蛋白质液相层析法［26］。本试验采用的电纯化法是基于蛋白质电荷不同电泳纯化法的一种蛋白纯化方法。通过该方法较准确且单一地回收了重组蛋白，该方法操作原理简单，用材简单且价格低廉等优点;对于存在于包涵体中蛋白而言，该方法省去了对包涵体溶解的过程。但是该方法也存在着一定不足，电纯化蛋白法操作时间相对较长。

综上，以原核表达系统快速获取重组蛋白，电纯化法获取纯化重组蛋白，为更好地在蛋白质水平研究ThbZIP1 转录因子的生物学功能打下了坚实的基础，并为木本植物专一性蛋白的获得提供经验借鉴。

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