冯启凯，曲梅花，季万胜，李　艳，辛　亭，黎瀚文，刘凤娇

(1.潍坊医学院,山东省高校应用药理学重点强化建设实验室，山东 潍坊　261053;

2.潍坊医学院附属医院，山东 潍坊　261031)



冰王烧烫膏对大鼠深Ⅱ度烧伤的修复及机制研究

冯启凯1，曲梅花1，季万胜2，李艳1，辛亭1，黎瀚文1，刘凤娇1

(1.潍坊医学院,山东省高校应用药理学重点强化建设实验室，山东 潍坊261053;

2.潍坊医学院附属医院，山东 潍坊261031)

摘要：目的研究探讨冰王烧烫膏对大鼠深Ⅱ度烧伤创面的修复及机制。方法雄性Wistar大鼠60只，制备深Ⅱ度烧伤创面的大鼠模型后，随机分为烧烫膏组、京万红组、烧伤模型组，每组20只。测量大鼠烧伤后1、3、7、13、21 d皮肤创面的愈合率和血清TNF-α含量；烧伤后4d免疫荧光法测glut-2受体的表达变化。结果烧伤后1 d各组创面愈合率比较，差异无统计学意义(P> 0.05)，7、13、21 d烧烫膏能明显缩短烧伤大鼠皮肤创面愈合的时间，提高愈合率(P<0.01)。烧伤后1、3、7、13、21 d烧烫膏组大鼠血清 TNF-α水平呈明显下降，与模型组比较差异有显著性(P<0.05，P<0.01)。和模型组比较，烧烫膏组glut-2受体表达数目增加，差异有统计学意义(P<0.01)。结论冰王烧烫膏对烧伤皮肤创面具有良好的修复作用并可能与降低血清 TNF-α水平和增加glut-2受体表达有关。

关键词：烧烫膏;烧伤;创面愈合;TNF-α; glut-2受体;荧光抗体反应

冰王烧烫膏系运用白矿油、白芝麻油、冰片等为主药制备而成的一种外用中药复合乳剂，在烧伤临床沿用多年，具有促进表皮细胞、组织细胞再生，有效避免瘢痕形成，减轻烧烫伤对皮肤的损伤度的功效，然而其作用机制一直未明。本实验通过观察冰王烧烫膏对大鼠深Ⅱ度烧伤创的治疗作用，探讨其可能的作用机制，为进一步促进其在临床广泛推广应用提供实验依据和理论基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试验动物雄性Wistar大鼠60只，SPF级，重量200～220 g，由山东鲁抗医药股份有限公司实验动物室提供，许可证号: SCXK鲁20130001。

1.1.2主要试剂和试验仪器冰王烧烫膏(平舆冰王生物工程有限公司，批号20140105)；京万红(天津达仁堂京万红药业有限公司，国药准字Z12020440，批号211897)；硫化钠(天津博迪化工股份有限公司)；肿瘤坏死因子-α酶联免疫检测试剂盒(上海恒远生化试剂有限公司)；Anti-Glut-2R (北京博奥森生物技术有限公司)；高速冷冻离心机(德国SIGMA公司)；奥林巴斯IX71显微镜(日本奥林巴斯公司)。

1.2试验方法

1.2.1大鼠分组及背部烧伤模型的制备wistar雄性大鼠60只，随机分为三组即烧烫膏组，京万红组，烧伤模型组，每组20只。用8%硫化钠溶液在实验前24 h对大鼠背部两侧皮肤进行脱毛，脱毛面积5 cm×6 cm左右，约1 min后用水充分清洗脱毛区，以防过度刺激皮肤。用3%戊巴比妥钠(40 mg·kg-1)腹腔麻醉后将大鼠四肢尽量伸展，于俯卧位固定在木质操作板上。室温下，将注满沸水直径4 cm一端无堵头的中空大离心管直立于大鼠脱毛部，与皮肤紧密接触且保证水不流出。沸水与皮肤持续接触15 s，将操作板及大鼠连同塑料管迅速翻转，造成深Ⅱ度烧伤模型(经病理组织学检查)，立即腹腔内注射乳酸钠林格氏液5 mL抗休克[1]。

1.2.2创面处理及给药烧烫膏组、京万红组每天早中晚3次分别涂以烧烫膏和京万红；模型组在相同时段涂无菌生理盐水。总给药时间持续4周。为防其舔舐伤口，所有大鼠造模后均在其头颈部套自制纸硬壳项圈。在给药期间，所有大鼠单独分笼饲养，自由饮水并给予普通饲料喂养。

1.2.3观察指标(1)大体观察每次换药时肉眼对比观察各组烧伤创面水肿渗出程度,是否有分泌物及创周红肿等。(2)观察创面愈合率按照Nagelschmidt法，于烧伤后不同时间用透明塑料薄膜覆盖于大鼠创面描记创面边缘，用规格相同纸壳按照描记的边缘剪下同样大小的面积进行称重。创面愈合判断标准是痂皮自行脱落且有新生上皮形成。以烧伤第1天的面积作为原始面积，以后各时间点测量的面积均和原始面积比。创面的面积转换为纸壳的重量，计算公式如下：

创面愈合面积百分比 =(原始烧伤面积-各时间点创面面积)/原始烧伤面积×100%。

记录实验后1、3、7、13、21 d各组大鼠创面愈合情况并对各组大鼠创面的平均愈合天数进行统计和计算。

1.2.4TNF-α的检测各组随机选取大鼠10只于烧伤后1、3、7、13、21 d经眼内眦采集静脉血1 mL，室温静置于离心管15 min自凝，3 000 r·min-1(r=16 cm)，离心10 min后取上层血清，于-80℃保存备用。血清中的TNF-α表达水平用ELISA法检测，具体按说明书所述方法操作。

1.2.5Glut-2受体的表达烧伤后4 d各组随机选取大鼠10只颈椎脱臼处死，取末端回肠2～3 cm，于4%多聚甲醛固定24 h，石蜡切片，抗原修复，封闭，37℃孵育1 h，Glut-2R(兔抗鼠，1∶200)+ 0.03% TritonX-100 室温过夜，PBS漂洗，荧光二抗FITC(山羊抗兔，1∶200)，37℃避光孵育1.5 h，PBS漂洗，甘油封片，荧光显微镜下观察，随机选取10个高倍视野(200×)，记录每个视野阳性细胞数目，取其平均值。

2结果

2.1创面大体观察烧伤后1 d，对照组大鼠创面颜色呈瓷白色，肿胀，渗出、创周红肿最明显。烧烫膏组与京万红组基本相似，仅有少许渗出及创周红肿。3 d后各组大鼠创面干燥，京万红组开始先后结痂，痂下未见异常分泌物。烧烫膏组无结痂，沿烧伤边缘愈合。各组大鼠均未见不良反应。

2.2创伤愈合率测定烧伤后1 d各组大鼠愈合率均较小，各组比较创面愈合率差异均无统计学意义(P> 0.05)；3 d后烧烫膏药组创面愈合率与模型组比较有统计学意义(P< 0.05)，京万红组与模型组比较，有显著差异(P< 0.01)；7、13、21 d烧烫膏组和京万红组愈合率均高于模型组(P< 0.01)；烧烫膏组和京万红组的平均愈合时间与模型组比较有明显差异(P< 0.01),见表1。

±s，n=10)

注：与模型组比较*P< 0.05，**P<0.01。

2.3烫伤膏对烫伤大鼠血清中 TNF-α水平的影响烫伤后1、3、7、13、21 d，烧烫膏和京万红组大鼠血清 TNF-α水平呈明显下降，与模型组比较差异有显著性(P<0.05，P<0.01),见表2。

注：与模型组比较*P<0.05 ，**P<0.01。

2.4大鼠glut-2受体表达比较空肠glut-2受体主要分布在肠上皮细胞基底膜[2]。烧烫膏组大鼠上皮细胞阳性细胞数为(10.83±2.23)，模型组大鼠的阳性细胞数为(6.68±1.67)，两组比较差异具有显著性意义(P<0.01)，烧烫膏组、京万红组大鼠表达glut-2的细胞数目无明显差异，见表3，图1。

±s)

注：与模型组比较,*P<0.05，**P<0.01。

注：A:烧烫膏组；B:京万红组；C:模型组。

3讨论

本实验结果显示冰王烧烫膏在烧伤后3 d开始不同程度的提高大鼠创面愈合率，缩短创面愈合时间。证明冰王烧烫膏能显著促进烧烫伤创面愈合。

深度烧伤创面的修复是一个全身性复杂有序、精密调控的过程，多种细胞炎症介质和生长因子在创面愈合过程中相互协调。在众多的炎症介质中，作为启动炎症反应关键分子的TNF-α、IL-1、IL-6起重要作用[3]。其中TNF-α可刺激外周血多形核白细胞(PMN)生成、释放和趋化反应，并活化产生大量毒性产物损伤组织细胞，同时TNF-α又可作用于肝细胞抑制白蛋白的生成和促进某些急性期蛋白合成[4]。所以TNF-α作为重要的促炎症因子，其水平的高低与炎症反应密切相关。本研究结果显示，在烫伤3 d后，烧烫膏各组能显著降低血清中 TNF-α含量。说明冰王烧烫膏能够抑制炎症介质 TNF-α释放，减轻创伤后炎症反应，进而促进创面愈合。

下丘脑—垂体—肾上腺系统在重度烧烫伤后被激活，糖皮质激素、儿茶酚胺等释放增加，导致机体出现高代谢反应，表现为基础能量消耗增加、糖酵解增强[5]等；另一方面，炎症因子又可导致葡萄糖转运蛋白表达减少、线粒体功能障碍等，使葡萄糖摄取和利用减少[6]，严重影响烧伤患者预后。故药物促进创面愈合同时纠正机体的代谢异常状态一直受到研究者的重视。易化性葡萄糖转运载体(glut-2)具有低亲和力和高米氏常数的特点，是葡萄糖运载的理想载体，在肝细胞和肠细胞中，发挥葡萄糖感受器的作用[7]。所有在血糖调节中起重要作用的组织如小肠、胰腺、肾及肝，都表达glut-2[8]。glut-2通过对葡萄糖的高度敏感性，确保了大量葡萄糖进出细胞的双向流动，有效调节葡萄糖浓度。本实验中，给予冰王烧烫膏外涂后，大鼠空肠上皮细胞基底膜glut-2阳性细胞数目与模型组数目相比明显升高。表明给予冰王烧烫膏后葡萄糖摄取和利用增加，进而提供炎症反应及创面愈合所需的能量和营养，促进愈合。

结果表明，冰王烧烫膏可显著提高大鼠深Ⅱ度烧伤创面的愈合率，缩短创面愈合时间，加速创面愈合，对于烧伤具有良好的治疗作用，并且可能与降低TNF-α含量，升高glut-2受体的表达有关，具体机制还需进一步研究。

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Study on repairing effect and mechanism of ice king burn-scald ointment

on deep grade II burn in rats

FENG Qi-kai1,QU Mei-hua1,JI Wan-shen1, et al

(1．DepartmentofPharmacology，WeifangMedicalCollege，WeifangShandong261053，China;

2.AffiliatedHospitalofWeifangMedicalUniversity,WeifangShandong261031，China)

Abstract：ObjectiveTo investigate repairing effect and mechanism of Ice king Burn-scald ointment on deep grade II burn wounds in rats.MethodsBurned skin wound was made in 60 wistar male rats in accordance with the literature.The rats were randomly divided into 3 groups: the burn-scald ointment treated group,the jingwanhong ointment treated group,the model group,with 20 rats in each group.Samples were collected after 1,3,7,13,21 days of burn to determine healing rates and serum levels of TNF-α content.Expression changes of glut-2 receptor were detected by immunofluorescence 4 days after burn.ResultsThere were no significant difference in the healing rates of the wound among the 3 groups after 1 day (P> 0.05).The healing rates of the wound were significantly higher in the burn-scald ointment group and the model group (P< 0.01) after 7,11,13,and 21 days.Compared with model group,glut-2 receptor expression was increased in the burn-scald ointment group,and the difference was statistically significant (P<0.01).ConclusionIce king Burn-scald ointment shows a notable repairing effect on burn wound.The mechanism may be associated with decreased serum levels of TNF- α content and increased glut-2 receptor expression.

Key words:ice kingburn-scald ointment; burn; wound healing; TNF-α;glut-2 receptor; fluorescent antibody technique

(收稿日期：2014-06-12，修回日期：2014-08-21)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.02.009

通信作者:曲梅花，女，副教授，硕士生导师，研究方向：神经内分泌药理学，E-mail: qumeihua@ hotmail.com

作者简介:冯启凯，男，硕士研究生

基金项目:国家教育部留学回国人员科研启动基金(2011年第43批)