秦　勤，李元海

(安徽医科大学第一附属医院麻醉科，安徽 合肥　230022)



GRP78与CHOP在缺血再灌注损伤中的作用

秦勤，李元海

(安徽医科大学第一附属医院麻醉科，安徽 合肥230022)

摘要:缺血再灌注(ischemia-reperfusion ,IR)过程中多种因素可导致内质网应激(endoplasmic reticulum stress response,ERS)，ERS参与缺血再灌注(ischemia-reperfusion injury,IRI)的发展过程。总结ERS抗凋亡标志物GRP78与促凋亡标志物CHOP在IRI中的作用。IRI时GRP78与CHOP表达的变化及其作用。明晰GRP78与CHOP参与IRI的机制。

关键词:GRP78；CHOP；缺血再灌注损伤

各种原因造成组织或器官血液灌流量减少时发生缺血性损伤，而恢复血液灌流后，细胞结构及功能破坏反而加重，这种缺血组织或器官重获血流灌注后损伤加重的现象称为缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury,IRI)。IRI发病因素包括缺血再灌注(ischemia- reperfusion,IR)过程中出现的葡萄糖匮乏、活性氧(reactive oxygen species,ROS)增多及钙稳态的破坏,这些因素均可导致内质网蛋白折叠功能受损，未折叠及错误折叠蛋白质在内质网腔内聚集，引发内质网应激(endoplasmic reticulum stress ,ERS)，为恢复细胞功能发生未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR),GRP78作为抗凋亡标志物在UPR发生后表达增加，促进内质网稳态、细胞结构及功能的恢复，在IR过程中引起ERS的刺激持续存在，ERS过强细胞结构及功能无法恢复，引起细胞死亡蛋白之一在ERS持续存在时表达增加，促进细胞凋亡，加重组织器官损伤。本文就IRI时GRP78与CHOP表达的变化及其作用做一综述。

1IR过程中可导致ERS发生的因素

1.1葡萄糖匮乏在IR中的缺血期葡萄糖匮乏，葡萄糖匮乏可引起ERS的发生,GRP78和CHOP表达均增加[1]。这一现象与葡萄糖匮乏导致细胞内ATP生成减少和内质网腔内蛋白质糖基化受抑，影响内质网蛋白折叠功能，引起未折叠蛋白和错误折叠蛋白在内质网腔聚集有关。

1.2活性氧(reactive oxygen species,ROS)增多Tsuda H等[2]发现抑制IR过程中ROS的产生可降低GRP78、CHOP的表达，说明在IRI过程中ROS的增多可引起ERS。IR过程中ROS的来源有黄嘌呤脱氢酶系统[2]、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶系统、线粒体电子传递复合体功能受损增多的电子漏[3]、线粒体通透性转换孔( mitochondrial permeability transition pore ,MPTP)开放产生活性氧导致的活性氧释放现象[4]等，IRI时ROS来源增多，而超氧化物歧化酶活性降低[3],细胞内ROS清除减少，因此细胞内ROS大量聚集。一方面ROS改变Ca2+释放通道1,4,5-三磷酸肌醇受体(inositol-1,4,5 -triphosphatereceptor,IP3R)构象促进内质网Ca2+释放,抑制内质网上Ca2+泵活性影响细胞质内Ca2+再摄取入内质网[5]，导致内质网内Ca2+稳态紊乱。另一方面ROS可攻击维持蛋白折叠酶活性所必需的游离巯基，使内质网腔蛋白折叠酶功能异常，蛋白折叠障碍，未折叠蛋白积聚并滞留于内质网腔。内质网内Ca2+稳态紊乱及未折叠蛋白积聚均可导致ERS的发生。

1.3内质网内Ca2+稳态紊乱内质网是贮存Ca2+、维持Ca2+稳态的重要细胞器之一，IR时内质网腔内Ca2+稳态发生变化。在Na+-K+-Cl-共同转换体、Na+/Ca2+交换体、IP3R共同作用下内质网内Ca2+在IR过程中呈现两种时相：缺血期氧-糖剥夺状态(oxygen-glucose deprivation ,OGD)下内质网内Ca2+超载，复氧后内质网内Ca2+向细胞质释放，出现Ca2+耗竭，内质网内Ca2+稳态紊乱可损害内质网蛋白折叠功能，未折叠蛋白在内质网积聚，引发ERS[6]。

2GRP78与IRI

2.1GRP78概述葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein78,GRP78)是热休克蛋白70家族成员之一[7]又名免疫球蛋白重链结合蛋白(immunoglobulin heavy chain binding protein,BIP)。它由具有ATP酶活性的ATP结合域、多肽结合域和活性调节域组成。生理状态下GRP78功能包括作为分子伴侣在内质网内与新生多肽以非共价键形式短暂地结合,促进蛋白质的正确折叠和装配,并协助蛋白质跨内质网膜转运；作为Ca2+结合蛋白与Ca2+结合，调节内质网内Ca2+浓度；与内质网常驻跨膜蛋白：RNA依赖的蛋白激酶样内质网激酶(RNA dependent protein kinase-like ER kinase ,PERK)、活化转录因子6(activating transcription factor 6 ,ATF6)、肌糖需酶1(inositol-requiring enzyme 1,IRE1)结合使这些跨膜蛋白处于无活性状态。

2.2GRP78表达增加途径在IR过程中细胞葡萄糖和ATP匮乏、ROS增多及内质网内Ca2+稳态紊乱综合作用下内质网腔内未折叠蛋白大量聚集，GRP78与PERK、ATF6、IRE1解离，PERK与GRP78解离后发生自身磷酸化、二聚化而活化，活化后的PERK磷酸化eIF2α使之活化，抑制细胞内大多数蛋白的合成，而ATF4mRNA优先翻译，ATF4作为转录因子促进ERS相关蛋白的表达，如GRP78。ATF6与GRP78解离后转移至高尔基体，被高尔基体常驻蛋白酶裂解，释放基本的亮氨酸拉链(basic leucine zipper ,bZIP) 转录因子促进包括GRP78的ERS反应原件的表达[8]。与GRP78解离的IRE1通过寡聚化及自身磷酸化而活化[9]，活化后的IRE1剪切X盒结合蛋白-1(Xbox binding protein 1,XBP-1)mRNA前体，翻译成转录因子XBP-1，促进GPR78的表达[8]。

2.3GRP78减轻IRILi H等发现选择性下调GRP78表达将增强视网膜IRI[10]。GRP78可通过以下方面减轻IRI。

2.3.1帮助蛋白正确折叠当未折叠蛋白中内质网腔内聚集时，GRP78与PERK、ATF6、IRE1解离，帮助未折叠蛋白正确折叠[11]。GRP78多肽结合域与未折叠蛋白结合，ATP酶结合域促进蛋白折叠,GRP78还具有转移内质网腔内错误折叠蛋白功能，使细胞中应激状态下蛋白质继续合成。

2.3.2抑制ROS引起的脂质过氧化GRP78可促进琨氧化还原酶抗体(NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1,NQO1)表达,还可促进还原性谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)的表达、抑制GSH的清除，NQO1及GSH均是细胞内的抗氧化剂，促进ROS的清除，促进细胞氧化还原状态的平衡，抑制脂质过氧化[12]。

2.3.3抑制内质网Ca2+渗漏易位子(translocon,TLC)是内质网膜上的Ca2+渗漏通道，正常情况下GRP78覆盖在TLC上参与内质网内Ca2+稳态的调节，在发生未折叠蛋白反应时GRP78与TLC分离，Ca2+渗漏增加，加重内质网Ca2+耗竭，在GRP78表达增多后，GRP78与TLC结合，使TLC关闭，抑制内质网Ca2+渗漏[13]。

2.3.4抑制胱冬酶(caspase)-12 激活在ERS下， caspase-7和caspase-12 相互作用，使caspase-12 裂解、激活，激活的caspase-12 引起ERS特异的细胞凋亡。在内质网应激初期,GRP78与caspase-7和caspase-12 形成复合物,抑制caspase-12激活及其从内质网释放,从而抑制caspase-12 激活相关细胞凋亡。

3CHOP与IRI

3.1CHOP概述CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer binding proteins homologous protein,CHOP)是CCAAT/增强子结合蛋白(CCAAT/enhancer binding protein)家族中的一员，又名生长停滞及DNA损伤基因153(growth arrestand DNA damage-inducible gene 153 ,GADD153)。生理状态下CHOP以很低的表达水平存在于细胞质中。当ERS持续存在时，CHOP的表达上调，促进细胞凋亡。

3.2CHOP表达增加途径ERS发生后PERK、ATF6、IRE1活化产生的转录因子ATF4、bZIP和XBP-1均可上调CHOP的表达，其中最重要的通路是PERK-磷酸化eIF2α-ATF4-CHOP通路。

3.3CHOP促进IRICHOP作为促凋亡转录因子，是介导ERS导致的细胞凋亡中至关重要的蛋白之一。Rao J等发现运用脂多糖预处理抑制肝细胞ATF4-CHOP通路及敲除ATF4基因显著减少CHOP表达均可抑制肝细胞凋亡，抑制IRI[14]，Yang JR等发现沉默CHOP表达可减轻IR导致的肾小管细胞凋亡[15]。CHOP可通过以下方面促进IRI。

3.3.1上调caspase-11表达[15]CHOP可上调caspase-11表达，caspase-11裂解caspase-1前体，激活caspase-1，激活的caspase-1可促进细胞炎症介质的释放及程序性细胞死亡。

3.3.2上调GADD34基因表达CHOP上调生长停滞与DNA损害可诱导基因34(growth arrest and DNA damage-inducible protein 34，GADD34)表达，GADD34使eIF2α在丝氨酸51位点脱磷酸化，导致细胞从蛋白翻译广泛受抑状态恢复[16]，蛋白翻译增多，导致更多未折叠蛋白在内质网中积聚及促凋亡蛋白的增多。

3.3.3上调内质网氧化酶-1α(endoplasmic reticulum oxidase-1α,ERO1α)表达ERO1α是内质网内一种氧化酶，CHOP可上调ERO1α的表达[17]，ERO1α表达上调一方面导致内质网内过氧化状态，增加内质网内错误折叠蛋白水平。另一方面激活IP3R使过多的Ca2+从内质网释放到线粒体中，促发细胞死亡。

3.3.4诱导肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体受体-2(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand Receptor-2,TRAILR2)的表达肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体(Tuoxidasemor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand ,TRAIL)是肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)超家族中的一员，主要作用是诱导细胞凋亡，TRAIL的作用主要受TRAIL受体(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor,TRAILR)调控[18]，TRAIL与TRAILR2结合导致TRAILR2寡聚化并募集FAS死亡结构域相关蛋白(FAS-associated protein with death domain,FADD)至TRAILR2羧基端的死亡结构域，导致caspase-8和caspase-10的聚集，形成多蛋白死亡诱导信号复合体。

3.3.5抑制B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2,Bcl-2)基因转录Bcl-2基因编码的Bcl-2蛋白属膜整合蛋白，定位于线粒体、内质网和连续的核周膜，是细胞存活促进因子，CHOP可抑制Bcl-2基因转录[19]，Bcl-2基因转录受抑导致细胞内硫醇耗竭，使细胞对可导致细胞死亡的刺激因素更为敏感，对有的细胞来说硫醇耗竭足以导致细胞凋亡。Bcl-2转录受抑还影响细胞内GSH稳态，在有些细胞中细胞内GSH稳态与细胞凋亡的调节密切相关。

3.3.6诱导与Bcl-2相互作用的细胞死亡调解子(Bcl-2 interacting mediator of cell death，Bim)的表达[20]Bim是Bcl-2家族中唯BH3同源结构域亚家族的成员,广泛分布于机体各种组织中，是一种重要的凋亡调节蛋白，具有促凋亡的活性。夏珍等发现明Bim通过内质网途径介导缺氧导致的心肌细胞凋亡[20]。CHOP和CCAAT增强子结合蛋白α(CCAAT enhancer bindingproteins α,C/EBPα)共同与Bim基因第一个内含子区某一位点结合促进Bim的表达，促进细胞凋亡。

4结语与展望

IR过程中葡萄糖匮乏、ROS增多及Ca2+稳态紊乱均可导致ERS的发生，通过UPR的三条通路GRP78表达增加，GRP78帮助细胞内稳态的恢复、抑制细胞凋亡而减轻IRI。由于IR时引起ERS的刺激持续存在，ERS过强细胞内稳态难以恢复，CHOP等促凋亡转录因子表达增加，通过下游信号通路促进细胞凋亡的发生加重IRI。目前我们对GRP78和CHOP在IRI发生发展中的作用的理解仍有限，未来随着IRI、ERS、GRP78及CHOP研究的深入我们将更全面掌握它们之间的关系，并可能发现通过改变GRP78及CHOP表达从而减轻IRI的方法。

参考文献：

[1]de la Cadena S,Hernández-Fonseca K,Camacho-Arroyo I,et al.Glucose deprivation induces reticulum stress by the PERK pathway and caspase-7 and calpain-mediated caspase-12 activation[J].Apoptosis,2014 ,19(3):414-427.

[2]Tsuda H,Kawada N,Kaimori J,et al.Febuxostat suppressed renal ischemia-reperfusion injury via reduced oxidative stress[J].Biochem Biophys Res Commun,2012 ,427(2):266-272.

[3]Tran T,Tu H,Pipinos I,et al.Tourniquet-induced acute ischemia-reperfusion injury in mouse skeletal muscles: Involvement of superoxide[J].Eur J Pharmacol,2011,650(1):328-334.

[4]Zorov D,Juhaszova M,Sollott S.Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release[J].Physiol Rev,2014,94(3):909-950.

[6]Wang C,Li Y,Wang X,et al.Panax quinquefolium saponins reduce myocardial hypoxia-reoxygenation injury by inhibiting excessive endoplasmic reticulum stress[J].Shock,2012 ,37(2):228-233.

[8]Raghubir R,Nakka V,Mehta S.Endoplasmic reticulum stress in brain damage[J].Methods Enzymol,2011,489:259-275.

[9]Chen L,Xu S,Liu L,et al.Cab45S inhibits the ER stress-induced IRE1-JNK pathway and apoptosis via GRP78/BiP[J].Cell Death Dis,2014,5:e1219.

[10] Li H,Zhu X,Fang F,et al.Down-regulation of GRP78 enhances apoptosis via CHOP pathway in retinal ischemia-reperfusion injury[J].Neurosci Lett,2014,575:68-73.

[11] Gardner B,Walter P.Unfolded proteins are Ire1-activating ligands that directly induce the unfolded protein response[J].Science,2011 ,333(6051):1891-1894.

[12] Suyama K,Watanabe M,Sakabe K,et al.GRP78 suppresses lipid peroxidation and promotes cellular antioxidant levels in glial cells following hydrogen peroxide exposure[J].PLoS One,2014,9(1):e86951.

[13] Hammadi M,Oulidi A,Gackière F,et al.Modulation of ER stress and apoptosis by endoplasmic reticulum calcium leak via translocon during unfolded protein response: involvement of GRP78[J].FASEB J,2013 ,27(4):1600-1609.

[14] Rao J,Qin J,Qian X,et al.Lipopolysaccharide preconditioning protects hepatocytes from ischemia/reperfusion injury (IRI) through inhibiting ATF4-CHOP pathway in mice[J].PLoS One,2013 ,8(6):e65568.

[15] Yang J,Yao F,Zhang J,et al.Ischemia-reperfusion induces renal tubule pyroptosis via the CHOP-caspase-11 pathway[J].Am J Physiol Renal Physiol,2014,306(1):F75-84.

[16] Mondal A,Das S,Varma V,et al.Effect of Endoplasmic Reticulum Stress on Inflammation and Adiponectin Regulation in Human Adipocytes[J].Metab Syndr Relat Disord,2012 ,10(4):297-306.

[17] Lu M,Lawrence D,Marsters S,et al.Opposing unfolded-protein-response signals converge on death receptor 5 to control apoptosis[J].Science,2014 ,345(6192):98-101.

[18] Teng Y,Gao M,Wang J,et al.Inhibition of eIF2α dephosphorylation enhances TRAIL-induced apoptosis in hepatoma cells[J].Cell Death Dis,2014 ,5:e1060.

[19] Liu K,Shi Y,Guo X.CHOP mediates ASPP2-induced autophagic apoptosis in hepatoma cells by releasing Beclin-1 from Bcl-2 and inducing nuclear translocation of Bcl-2[J].Cell Death Dis,2014 ,5:e1323.

[20] 夏珍,李菊香,丁浩,等.内质网应激在Bim 介导缺氧致心肌细胞凋亡中的作用[J].中国病理生理杂志,2013,29( 12): 2121-2127.

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The role of GRP78 and CHOP in ischemia-reperfusion injury

QIN Qin,LI Yuan-hai

(DepartmentofAnesthesiology，TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230022,China)

Abstract:A variety of factors in ischemia-reperfusion(IR) can result in endoplasmic reticulum stress response(ERS),and ERS participates in the development process of ischemia-reperfusion injury(IRI).To summarize the role of anti-apoptotic mark GRP78 and pro-apoptotic mark CHOP in IRI.The expression and function of GRP78 and CHOP in IRI.Clarify the mechanism of GRP78 and CHOP participation in IRI.

Key words:GRP78; CHOP; ischemia-reperfusion injury

作者简介：姜文青,女,硕士研究生

(收稿日期：2014-06-21，修回日期：2014-07-18)

通信作者：李元海,男，主任医师，博士生导师，研究方向：危重症学，E-mail:liyuanhai-1@163.com 张亚中,男,硕士生导师,副主任中药师,研究方向：中药质量标准研究，E-mail: yazhongzhang@hotmail.com

基金项目：安徽省科技攻关项目(No 1301042204) 安徽省食品药品监督管理局基金项目(No 20120007);安徽省研究生“千人计划”基金项目

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.02.002