刘轩豪，蒯 健，傅丽华，贾建波

(淮阴工学院 生命科学与食品工程学院，江苏 淮安 223003)

橙色粘球菌微生态制剂的制备和应用

刘轩豪，蒯 健，傅丽华，贾建波*

(淮阴工学院 生命科学与食品工程学院，江苏 淮安 223003)

将橙色粘球菌JCH-04的发酵液通过微孔滤膜浓缩制成微生态制剂，通过抑菌试验，结果表明该品对水中常见的6种病原微生物具有较强的抑制作用。通过对草鱼灌服该制剂测试其安全性，结果表明橙色粘球菌JCH-04菌株对草鱼安全无毒，且产生的多种消化酶：淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶，均具有较高的活性，说明该菌株可以作为在水产品养殖中具有安全性和潜在应用价值的外源益生菌使用。

橙色粘球菌；微生态制剂；益生菌

0 引言

粘细菌(Myxobacteria)是一类具有复杂多细胞行为的原核生物，在细胞的生长、摄食、运动和分化发育等方面表现出显著的社会性特征。近年来研究发现，粘细菌作为一类重要天然产物的生产者，可产生异常丰富的次级代谢产物，是重要的、具有巨大药物开发潜力的药源菌类群[1-2]。

粘细菌作为微生态制剂在水产养殖业方面的应用，其最重要的特性就是粘细菌作为一种捕食性微生物，能够吞噬大肠杆菌及其它一些革兰氏阴性菌，它分泌的胞外活性物质对真菌和细菌具有较强的抗性[3-4]，因此具有以菌治菌的生物防治作用；粘细菌还能产生消化酶将蛋白质、核酸、酯类等大分子物质分解，有利于饲料消化率的提高；粘细菌及其酶，从菌来说，未发现其有害作用，从酶来说，化学成分是蛋白质，故不会产生对环境的污染和对人体健康的危害[5-6]。利用粘细菌作为饲料添加剂，将在防病抗病、提高水产品养殖生产力方面发挥巨大的潜能，并有利于绿色环保型水产品的生产[7]。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

橙色粘球菌(Myxococcus fulvus) JCH-04，保藏号为CGMCC No.2893。

1.2 实验用病原微生物指示菌株

大肠杆菌(Escherichia coli)，次副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)，霍乱弧菌(Vibri cholera)，嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)，铜绿假单胞菌(Pseudomons aeruginosa)，水生黄杆菌(Flavobacterium aquatile)。

1.3 培养基

CY培养基为：酪素水解蛋白胨3g，酵母膏1g，氯化钙1g，去离子水定溶至1000mL，pH 7.4；

发酵培养基为：可溶性淀粉10g ，黄豆粉15g，葡萄糖2.5g，酵母膏0.5g , CaCl21g， MgSO4·7H2O 0.5g，去离子水定溶至1000mL，pH 7.4；

营养琼脂培养基(MH )：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，去离子水定溶至1000mL，pH 7.2～7.4。

1.4 微生态制剂的制备

(1) 菌株提取

取一株橙色粘球菌(Myxococcus fulvus) JCH-04，保藏号为CGMCC No.2893，菌株在CY培养基上30℃培养3天，在发酵培养基中30℃、180rpm摇瓶培养5天。

(2) 菌株活化

从斜面挑取一环菌种接种于CY液体培养基中试管30℃培养3天，再将接种于装有发酵培养基试管中30℃培养3天，接种量为106CFU/mL，反复3次。

(3) 菌株扩培

将步骤(2)的液体菌种接种于装有发酵培养基三角瓶中30℃、180rpm摇瓶培养5天，接种量为106CFU/mL。

(4) 菌株收集浓缩

在无菌条件下，将步骤(3)的摇瓶培养菌液用0.2μm微孔滤膜过滤浓缩成500亿CFU/mL菌液，获得的浓缩菌液为微生态制剂。

1.5 橙色粘球菌JCH-04对病原微生物抗菌实验

将指示菌用无菌生理盐水稀释成不同梯度，测定OD600并涂平板，确定不同细菌最适涂布浓度OD600为0.02～0.03 ，将不同指示菌0.2ml 均匀涂于直径为9cm平板表面，晾干，在平板不同位置等距离放置高温灭菌的牛津杯，再将培养浓缩得到的橙色粘球菌(Myxococcus fulvus) JCH-04菌液，用无菌枪头吸取200μl加于牛津杯，牛津杯直径5mm ，在37℃下培养16-24 小时，测量抑菌圈直径。培养次副溶血性弧菌MH培养基中加盐量为3%，培养霍乱弧菌MH培养基中pH为8.8，其它不变，同MH培养基；其它指示菌培养用培养基同MH培养基。

1.6 橙色粘球菌JCH-04安全性试验

将橙色粘球菌(Myxococcus fulvus) JCH-04培养，用生理盐水调节菌液的浓度分别为108、109、1010CFU/mL。试验开始前24h停止投喂，对草鱼(体重20g左右/尾)采用灌服的方法，剂量为

0.5mL/尾，每组鱼30尾，以同浓度的嗜水气单胞菌和生理盐水做对照，每组设6个重复，记录观察20d累计死亡情况。

1.7 橙色粘球菌JCH-04在草鱼养殖饲料中的应用

草鱼饲料配方:鱼粉12%，花生粕20%，豆粕15%,膨化大豆粉5%，麸皮15%，棉粕11%，次粉8%，维生素预混料0.6%， 矿物质预混料2%，植物油1.4%。

菌剂加入方法：将鱼饲料制成直径为5mm 的颗粒料，用喷涂机采用外喷涂方法，等菌液浸入到颗粒料内再低温烘干；鱼饲料菌剂加入量为108CFU/g。

2 结果与分析

2.1 抗菌实验结果

表1 JCH-04菌株对不同细菌的抑制作用

由表1可见，抑菌圈直径均大于10mm，说明橙色粘球菌(Myxococcus fulvus) JCH-04对所列6种病原微生物指示菌具有较强的抑菌作用。

2.2 安全性试验结果

结果表明，灌服108、109、1010CFU/mL嗜水气单胞菌的草鱼死亡率分别为89.67%、97.67%、100%，将草鱼屠宰取肝和脾脏，做电镜切片观察，肝、脾细胞形态异常，病变特征明显。灌服108、109、1010CFU/mL Myxococcus fulvus JCH-04的草鱼和空白对照组在试验期间采食和生长均正常，无死亡。将草鱼屠宰取肝和脾脏，做电镜切片观察，肝、脾细胞形态正常，未见病变特征，说明Myxococcus fulvus JCH-04菌株对草鱼安全无毒，可以作为在水产品养殖中具有安全性和潜在应用价值的外源益生菌使用。

2.3 产消化酶能力测定结果

分别测定发酵液中的淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶活力，平行测三组，取平均值，测定结果如表2所示。

表2 三种消化酶活力测定

由表2可见，测定发酵液中淀粉酶活力为3148.8 U/mL，蛋白酶活力为78.5 U/mL和脂肪酶活力为48.4 U/mL；益生菌能产生胞外酶，分泌到周围环境中，尤其是在动物的肠道中，往往是益生菌发挥营养作用的原因之一；该菌株可以产生淀粉酶和蛋白酶、脂肪酶，因此，当该菌在动物的肠道存活时，就有可能分泌消化酶辅助消化，进而提高饲料的消化率。

2.4 在草鱼养殖饲料中的应用情况

将橙色粘球菌(Myxococcus fulvus) JCH-04制备的微生态制剂添加到水产饲料中，经饲喂实验证明：饲料转化率达到1.84%，成活率达到

96.2%，死亡率减低了27.7%；对其免疫保护率也有一定的提高；从生长性能的指表反映，菌剂的添加可改善草鱼生长性能；同时对草鱼体内消化酶指标测定表明：菌剂的添加可显著提高淀粉酶活性，对脂肪酶和蛋白酶活性也有一定提高。

3 讨论

饲用微生态制剂是一种多功能的绿色饲料添加剂，它在促生长、防病抗病、提高水产品质、提高养殖效益、改善环境等方面具有明显效果且无毒副作用，通过本实验对微生态制剂的作用机理进行系统地研究，将极大地促进微生态制剂的研制、生产与应用，其在饲料工业中有着极为广泛的用途，并且其新用途还将被不断发现和开发。

近年来，随着生物技术在我国的发展，水产养殖用高效饲用微生态添加剂，以其安全绿色高效、可替代饲用抗生素又无药残、无副作用，正在饲料工业中生产规模逐渐扩大，形成产业，已成为饲用添加剂的一个发展方向，它对我国抗生素替代产品的大面积推广应用、 提高饲料产品质量以及生产无公害水产类食品，将起到重要作用[8-14]。

将筛选到的一株新的粘细菌制备成微生态制剂，并对其进行了抗菌实验、酶活性测定、安全性试验和作为草鱼饲料添加剂的饲喂实验。结果表明该微生态制剂具有简单易制得、安全高效等特点，可以作为在水产品养殖中具有安全性和潜在应用价值的外源益生菌使用。

[1] 李艳利，张荫雷，刘迎，等.一株新粘细菌生物学性质的研究[J].微生物学通报，2008，35(12)：1888-1891.

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[13] 王芸，郑宗林.微生态制剂在水产养殖中的应用研究进展[J].饲料与畜牧，2013，27(2)：18-24.

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(责任编辑：蒋 华)

Preparation and Application of the Microecologics of Myxococcus Fulvus

LIU Xuan-hao, KUAI Jian, FU Li-hua, JIA Jian-bo*

(Faculty of Life Science & Food Engineering,Huaiyin Institute of Technology,Huai'an Jiangsu 223003,China)

The zymotic fluid of Myxococcus fulvus was concentrated by passing through a micropore filter membrane to make microecologics. The results of experiments showed that the microecologics had strong inhibition to the growth of six common pathogenic microbes. Through feeding grass carp with the microecologics, It was found that the Myxococcus fulvus JCH-04 was safe to grass carp. It can also produce many digestive enzymes with high activity, such as amylase, protease and lipase. It indicated that the Myxococcus fulvus could be used as safe exogenous probiotics and have potential application value in aquatic products breeding.

Myxococcus fulvus; microecologics; probiotics

2014-11-29

江苏省高校科研成果产业化推进工程项目(JHB2012-59)

刘轩豪(1991-)，男，江苏徐州人，在读硕士，主要从事生物化工方面的研究；*为通讯作者。

R978

A

1009-7961(2015)05-0004-03