任广旭，朱大洲，张鸿儒，卢林纲，王 靖，秦玉昌

(农业部食物与营养发展研究所/中国农业科学院双蛋白工程技术研究中心/农业部农产品质量与营养功能风险评估试验室，北京 100081)

运动能够使机体耗氧增加，造成骨骼肌肌联蛋白、伴肌动蛋白含量下降、膜骨架蛋白降解等不利影响，进而引起运动疲劳和损耗，降低运动能力。合理的营养改善能够抵抗运动疲劳，减缓运动损耗［1］。乳清蛋白在运动营养改善领域已经被广泛应用，它能够改变血液谷胱甘肽浓度，提高机体抗氧化能力，有效促进肌肉生长与恢复［2］。最新研究发现，大豆蛋白与乳清蛋白组成的双蛋白能够显著增强运动后肌肉蛋白的合成，但具体的分子机制尚不明确［3］。从蛋白质氨基酸组成模式的角度分析，乳清蛋白与大豆蛋白均属于优质蛋白质。大豆蛋白是目前所知的唯一含有9 种必需氨基酸的蛋白质［3］。必需氨基酸尤其是支链必需氨基酸对肌肉蛋白的合成至关重要［4］。由于大豆蛋白与乳清蛋白具有不同的消化吸收模式，那么由大豆蛋白与乳清蛋白组成的双蛋白在生理状态下必需氨基酸的消化释放模式是什么，目前尚不清楚。本研究利用Wistar 大鼠负重运动模型研究双蛋白摄入后，生理状态下必需氨基酸动态释放模式变化规律。

1 材料与方法

1.1 试验动物

6w 龄雄性健康洁净级(SPF 级)Wsitar 系雄性老鼠18 只，购于北京维通利华试验动物有限公司。试验动物合格证为No.11400700105348、生产许可证号:SCXK (京)2012-0001。饲养与标准环境，自由饮水，12h 光照周期，采用IVC 大鼠饲养系统。试验操作严格遵照中国动物实用指南。

1.2 试验材料

蛋白质:食品级大豆分离蛋白(以下简称“大豆蛋白”)，干蛋白质含量＞90%，购于山东禹王集团;乳清蛋白，干蛋白含量为94.6%，购于美国Hilmar。饲料:SPF 级大鼠维持饲料，购于北京科奥协力饲料有限公司。

1.3 大鼠静水游泳运动模型

游泳用水取自符合卫生标准的生活用水，使用前进行高温高压处理。水深控制在2 倍于大鼠身长［5］。根据Dawson［6］报道，水温选择30～35℃之间使其更接近正常大鼠体温。通过尾巴缠绕铅皮的方式进行负重运动，负重量为每只大鼠体重的10%。在运动过程中随时观察大鼠的状态，当其全身浸没水中10s 后仍不能通过努力返回水面，作为力竭发生的判断标准［5，7］。运动完成后，尽快对大鼠进行保温处理，用毛巾将毛擦拭干后放在干燥垫料的鼠笼中。

1.4 试验流程

将18 只雄性Wistar 大鼠随机分成3 组，大豆蛋白组(6 只)、乳清蛋白组(6 只)和混合蛋白组(6 只)。试验开始前对所有大鼠进行1w 的适应性饲养，适应期间自由饮食、饮水、每天进行1 次适应性游泳训练。第二周，试验开始前对大鼠进行12h 的空腹处理，12h 后通过尾巴静脉采血收集每只大鼠的本底血，采集血量为400μL，静置在冰上。采血后30min 进行负重游泳，达到力竭时刻停止运动。运动结束10min 后，通过灌胃进行蛋白营养干预，每只大鼠灌胃量为2mL，大豆蛋白、乳清蛋白及双蛋白(大豆蛋白:乳清蛋白=1∶1)灌胃浓度 均 为200mg/2mL。灌 胃 后30、60、90、120、150min 分别采集尾静脉血。

1.5 必需氨基酸检测

利用串联质谱(LG-MS/MS，AB)测定血清中苯丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、色氨酸、苏氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和组氨酸的含量。所有血清样本氨基酸检测均由北京迪安临床检验所完成。

1.6 统计学方法

采用SPSS17.0 软件进行数据分析，组间比较采用单因素方差分析，P ＜0.05 为差异就有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 Wistar 大鼠体征信息

为减少新环境诱发的动物应激反应，在正式试验前所有Wistar 大鼠需要进行为期1w 的适应性饲喂，适应期间采取自由饮食的方式，每天完成一次游泳训练，以消除大鼠对游泳的恐惧。第二周，试验前检测每只大鼠体重，乳清蛋白组体重为284.8 ±12.2g、大豆蛋白组体重为276±10.9g、双蛋白组体重288.8±1.64g (附表)。对于大鼠来说，单纯的自然游泳运动强度很小，不利于评价抗性运动后营养补充后氨基酸释放的动态变化规律，因此为了评价抗性运动后营养补充对必需氨基酸的动态释放规律，游泳时需要尾部负重。根据预试验的数据选择10%的体重为最佳负重量(附表)。负重运动开始后计录每只大鼠的力竭时间，乳清蛋白组86.8 ±25.9s、大豆蛋白组88.1 ± 43.7s、双蛋白组83.1±16.0s。

2.2 支链必需氨基酸浓度动态变化

一次性力竭运动后，将3 组大鼠分别摄入相同浓度(200mg/2mL)的乳清蛋白、大豆蛋白和双蛋白。结果显示:3 组蛋白干预模式下支链必需氨基酸的动态变化规律相似。亮氨酸动态变化(图1 A):蛋白摄入后30min，3 组亮氨酸浓度均到达峰值。乳清蛋白和双蛋白峰值浓度相同，显著高于大豆蛋白组。与乳清蛋白相比，蛋白摄入后120min 内能够保持持续性的高浓度亮氨酸。第150min 3 组血清亮氨酸浓度恢复一致。异亮氨酸动态变化(图1 B):第30min 乳清蛋白和双蛋白所释放的异亮氨酸浓度相同，但是乳清蛋白此时已经达到峰值，而大豆蛋白组和双蛋白组均在60min 达到峰值。从30～120mim 双蛋白组异亮氨酸浓度持续性高于其他两组，大豆蛋白则相较于其他两组异亮氨酸浓度含量一直处于较低水平。缬氨酸动态变化(图1 C):3 组缬氨酸血清浓度都在第60min 达到峰值，在此期间乳清蛋白组与双蛋白组缬氨酸释放浓度水平一致，均高于大豆蛋白组。从60～150min，乳清蛋白组缬氨酸浓度开始低于双蛋白组，但始终高于大豆蛋白组。

附表 Wistar 大鼠基本体征信息

图1 支链必需氨基酸浓度动态变化

图2 非支链必需氨基酸浓度动态变化

2.3 非支链必需氨基酸浓度动态变化

非支链氨基酸中赖氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、组氨酸和甲硫氨酸在3 种营养干预中没有显著的统计学差异(图2)。3 组必需氨基酸的变化规律相似，除苏氨酸外，其余氨基酸都在蛋白摄入后第30min 达到了各自的释放峰值(图2 A、B、C、E、F)。色氨酸的动态变化规律:双蛋白组从蛋白摄入后第30～150min，色氨酸浓度都显著高于乳清蛋白组。乳清蛋白组则从第60～150min 与大豆蛋白所释放的色氨酸浓度趋于一致。最后，3 组色氨酸浓度在第150min 达一致。

3 讨论

由于不同蛋白质氨基酸组成模式和种类不同，加之高级结构的差异，导致不同蛋白质在消化过程中氨基酸释放速率和模式不尽相同。乳清蛋白易溶于酸性溶液，胃部强酸的环境能够加速其消化降解属与快速降解蛋白，相对于乳清蛋白大豆蛋白则属于缓慢降解蛋白［8］。最近，美国德克萨斯医学中心Basmussen 研究小组通过临床队列研究揭示大豆蛋白与乳清蛋白组成的双蛋白能更有效地促进抗性运动后肌肉蛋白合成［9］，然而，目前尚不清楚乳清蛋白与大豆蛋白之间是如何发挥协同作用促进运动后肌肉恢复。研究显示，必需氨基酸尤其是以亮氨酸为代表的支链必需氨基酸对于肌肉蛋白的合成至关重要［4］。大豆蛋白含有16 种氨基酸，是目前已知的唯一含有9 种必需氨基酸的蛋白质［10］，乳清蛋白则含有人体必需的8 种氨基酸，且支链氨基酸含量丰富［11］。

本研究结果表明，Wistar 大鼠在完成一次性力竭游泳后，无论单独或是混合摄入2 种蛋白均能在干预后的30～60min 内达到必需氨基酸的释放峰值。由于支链氨基酸对于运动后肌肉的恢复至关重要，因此我们分别将9 种必需氨基酸根据分子结构特点，分成支链氨基酸和非支链氨基酸两组。蛋白摄入后的前30min 内，乳清蛋白组和双蛋白组血液中支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)的浓度相似，都显著高于大豆蛋白组。这可能是由于大豆蛋白的消化速率低于乳清蛋白所造成的，在前30min 内大豆蛋白尚未完全消化释放，双蛋白组血液中支链氨基酸主要来自于乳清蛋白，从而形成前30min 乳清蛋白组与双蛋白组差异不明显。从30～120min 双蛋白组血液中支链氨基酸浓度显著高于乳清蛋白组，而大豆蛋白组依然低于乳清蛋白组。从30min后，双蛋白组中大豆蛋白开始逐步达到释放峰值(异亮氨酸和缬氨酸的释放峰值时间为第60min)。与乳清蛋白相比，双蛋白组此后持续性的高支链氨酸释放可能是由于大豆蛋白释放的高峰阶段的叠加效应以及乳清蛋白释放不足共同决定的。120min 以后，3 种干预之间支链氨基酸的释放水平恢复一致，没有明显的统计学差异。此外，非支链氨基酸中出色氨酸外，3 种不同干预所释放的氨基酸水平和动态变化特点基本一致，没有显著的统计学差异。而对于色氨酸来说，双蛋白干预组浓度始终显著高于乳清蛋白组和大豆蛋白组，大豆蛋白浓度在所检测的时间点均低于乳清蛋白组。

综上所述，运动后摄入“大豆+乳清”双蛋白能够维持高浓度的色氨酸及支链氨基酸持续性释放，单独补充乳清蛋白只能短暂地(蛋白摄入后30min)增加血液中支链氨基酸浓度，单独补充大豆蛋白则能持续性地维持低浓度的支链氨基酸。对于赖氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、组氨酸和甲硫氨酸2 种蛋白的单独摄入或混合摄入不影响除色氨酸外的其他非支链氨基酸的浓度释放水平。因此，本研究揭示，运动后及时补充“大豆+乳清”双蛋白能够更持久地保持高浓度色氨酸和支链氨基酸的释放。

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