刘建奎，魏春华，戴爱玲，李晓华，杨小燕（龙岩学院生命科学学院预防兽医学与生物技术福建省高等学校重点实验室，福建省人畜寄生与病毒性疫病防控工程技术研究中心，福建龙岩364012）

福建地区猪繁殖与呼吸综合征ORF7基因遗传变异分析

刘建奎，魏春华，戴爱玲，李晓华，杨小燕
（龙岩学院生命科学学院预防兽医学与生物技术福建省高等学校重点实验室，
福建省人畜寄生与病毒性疫病防控工程技术研究中心，福建龙岩364012）

摘要：为了解福建地区猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）流行毒株的分子生物学特性与变异规律，收集了福建省不同地区的12株PRRSV，并对其ORF7基因进行遗传变异分析。结果表明，福建地区存在欧洲型PRRS和美洲型PRRS，10株为美洲型PRRSV，与VR-2332、JXA1等美洲型参考毒株的氨基酸的同源性为89.5%～100%，与欧洲代表毒株LV的氨基酸的同源性分别为59.5%～63.6%。而FJ-11、FJ-12 2株分离株为欧洲型PRRSV，与欧洲代表毒株LV的氨基酸的同源性分别为91.4%、92.2%，而与VR-2332、CH-1а等美洲参考毒株的氨基酸的同源性为60.3%～64.5%。美洲型PRRSV ORF7编码N蛋白氨基酸虽然发生了变异，但相对保守。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；ORF7基因；遗传变异

Corresponding author：YANG Xiao-yan

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种高度传染性疾病，给各国养猪业造成巨大的经济损失。PRRS首先于1987在美国发生，1991年首次分离于欧洲，我国于1996年首次发现并分离到PRRSV。PRRSV为单股正链RNA病毒，约15 kb，有9个开放阅读框[1-2]。PRRSV可以分为2种基因型，即以LV毒株为代表的欧洲型和VR-2332毒株为代表的美洲型，两者之间的核苷酸同源性为60%左右[3]。ORF7编码的N蛋白保守性较好，在病毒粒子中含量较高，在病毒组装和释放中发挥重要作用，并且具有良好的免疫原性和反应原性[4-5]。

研究表明，根据ORF7基因序列与基于全基因组序列构建的遗传进化树最为吻合，因此ORF7基因可作为研究PRRSV遗传进化的重要靶基因[6-8]。本文通过对福建地区PRRSV ORF7基因进行序列分析，探求其分子流行特征和变异规律，以期为控制PRRS的流行提供一定的参考依据。

1　材料与方法

1.1病毒样品2009-2013年在福建省的龙岩、厦门、漳州等地区采集疑似PRRS病料，由本实验室分离鉴定并保存的12株PRRSV。

1.2主要试剂M-MuLV反转录酶、RNA酶抑制剂、Taq DNA聚合酶，均购自宝生物工程（大连）有限公司；胶回收试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3引物参考VR-2332和LV序列，设计一对能同时扩增欧美毒株ORF7基因的引物，扩增片段大小约为630 bp，引物由华大基因科技服务有限公司合成。

1.4RT-PCR扩增用TRIZol裂解法提取病毒RNA，按照TaKaRa试剂盒说明书进行RT-PCR。

1.5目的基因的克隆与序列分析将阳性重组菌株交由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。利用MEGA 6.0软件对ORF7基因序列进行遗传变异分析。

2　结果

2.1RT-PCR扩增结果12株PRRSV分离株ORF7基因经RT-PCR扩增后，结果显示在约630 bp出现与预期大小相符的片段（图1）。

2.2ORF7基因序列分析及基因推导氨基酸序列的变异分析测序结果表明，FJ01-FJ10等10株分离株的ORF7基因序列与VR-2332、CH-1а、JXA1等美洲PRRSV毒株的核苷酸、推导氨基酸的同源性分别为89.8%～99.7%和89.5%～100%，而与欧洲代表毒株LV的核苷酸、推导氨基酸的同源性分别为67.5%～68.3%和59.5%～63.6%。N蛋白氨基酸位点变异分析表明，与VR-2332株相比福建地区毒株大部分发生散在的点突变，其中R11→K11、D15→N15、K46→R46、T91→A91，H109→Q109、V117→A117的突变相同，在N蛋白较为保守的B细胞表位（79 -87 aa）中，只有FJ-05、FJ-08和FJ-09株发生了Q80→H/R80的突变，其余毒株均未发生突变。FJ-11、FJ-12 2株分离株的ORF7基因序列与欧洲代表毒株LV的核苷酸、推导氨基酸的同源性分别为92.4%、93.5%和91.4%、92.2%，而与VR-2332、CH-1а、JXA1等美洲毒株的核苷酸、推导氨基酸的同源性分别为66.1%～66.9%和60.3%～64.5%（图2，图3），N蛋白氨基酸位点变异分析表明，与LV株相比FJ-11、FJ-12 2株分离株有散在的点突变，其中I34→M34、K58→R58、A127→V127的突变相同，其中FJ-11株在128位缺失一个氨基酸。

图1　PRRSV福建分离株ORF7基因的RT- PCR扩增结果

2.3ORF7基因的遗传进化树分析将福建省PRRSV分离株与国内外PRRSV参考毒株的ORF7氨基酸序遗传进化树分析，结果见图4，从进化树可看出福建12株分离株为两大基因群，即以VR-2332为代表的美洲毒株群和以LV为代表的欧洲毒株群。美洲毒株群分为两个亚群，以FJ-01为代表的6株分离株与其他HP-PRRSV变异株(如JXA1、HuN4等)位于同一大分支中，亲缘关系较近。以FJ-07为代表的3株分离株与VR2332亲缘关系较近同一大分支中。FJ-11和FJ-12 2株分离株与LV毒株位于一个大的分支中，亲缘关系较近，表明这两株毒株为欧洲型PRRSV。

图2　PRRSV福建分离株与参考株ORF7基因推导氨荃酸序列的比较

图3　PRRSV福建分离株与参考株ORF7基因推导氨基酸序列的比较

图4　PRRSV福建分离株与参考毒株ORF7氨基酸序列系统进化树分析

3　讨论

ORF7基因编码的N蛋白是病毒粒子中含量最高的蛋白，也是免疫原性最强的蛋白。N蛋白不仅是目前PRRS血清学诊断方法的抗原基础，还是PRRSV基因分型和抗原分型的主要依据[6-8]。因此本研究对12株PRRSV ORF7基因序列及其所编码的蛋白进行变异分析，为科学预防该病提供参考依据。

以FJ-01为代表的10株美洲型福建PRRSV分离毒株ORF7基因推导的氨基酸序列同源性为89.5%～100%，与美洲型代表株VR-2332、JXA1等毒株推导氨基酸的同源性分别为89.5%～100%，而与欧洲代表毒株LV推导氨基酸的同源性为59.5%～63.6%。FJ-11、FJ-12 2株分离株的ORF7基因推导的氨基酸序列欧洲代表毒株LV的ORF7基因推导氨基酸的同源性分别为92.4%和93.5%，而与VR-2332、JXA1等美洲毒株ORF7基因推导氨基酸的同源性为60.3%～64.5%。氨基酸遗传进化树表明，福建地区PRRSV分离株分为2个基因群，以FJ-01为代表的美洲基因群和以FJ-11、FJ-12为代表的欧洲基因群，美洲基因群分为两大亚群，以Ⅰ亚群为主，以FJ-01为代表的6株毒株其他HP-PRRSV变异株（如JXA1、HuN4等）亲缘关系较近，位于同一分支，表明这6株分离株可能为变异毒株。Ⅱ亚群中FJ-08和FJ-09毒株与疫苗株亲缘关系较近为独立的一个小分支且存在多个有散在的点突变，可能在选择压力（免疫和环境压力等）下由疫苗株变异而来，而II亚群中FJ-07和疫苗株序列一致，表明该毒株为疫苗株。氨基酸位点分析发现与VR-2332株相比，福建地区美洲型毒株大部分发生散在的点突变，而33-71aa，74-86 aa，102-125 aa为N蛋白的保守区域。在N蛋白较为保守的B细胞表位（79-87 aa）中，只有FJ-05、FJ-08和FJ-09发生了Q80→H/R80的突变，其余毒株均未发生突变，表明B细胞表位所在的区域高度保守。与LV株相比F-J11、FJ-12 2株分离株有散在的点突变，其中FJ-11分离株在128位缺失一个氨基酸。这些位点的突变及缺失对N蛋白的抗原性及对PRRSV的致病性有何影响，还有待于进一步研究。同时，福建地区田间存在欧洲型PRRS，但是关于欧洲型PRRS的来源和生物学特性需要进一步研究。

综上所述，福建地区美洲型PRRSV ORF7基因高度保守，N蛋白仍是现今较为理想的检测抗原，应该考虑到由于PRRSV不断变异，不同毒株的ORF7基因序列有一定的差异性。同时应该加大对欧洲型PRRSV的监控力度，采取有效的防控措施避免欧洲型PRRSV的流行。

参考文献：

[1] Dea S，Gagnon C A，Mardassi H，et al.Current knowledge on the

structural proteins of porcine reproductive and respiratory syn⁃drome（PRRS）virus: comparison of the North American and Euro⁃pean isolates [J].Arch Virol，2000，145（4）：659-688.

[2] Meulenberg J J，Hulst M M，de Meijer E J，et al.Lelystad virus, the causative agent of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome（PEARS），is related to LDV and EAV [J] . Virology，1993，192（1）：62-72.

[3] Nelsen C J，Murtaugh M P，Faaberg K S . Porcine reproductive and respiratory syndrome virus comparison：divergent evolution on two continents [J].J Virol，1999，73：270-280．

[4] Conzelmann K K，Visser N，Van Woensel P，et al . Molecu⁃lar characterization of porcine reproductive and respiratory syn⁃drome virus，a member of the arterivirus group[J] . Virol，1993，193：329-339.

[5] Bastos R G，Dellagostin O A，Barletta R G，et al . Immune re⁃sponse of pigs inoculated with Mycobacterium bovis BCG express⁃ing a truncatedform of GP5 and M protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus [J].Vaccine，2004，22：467-474.

[6] Kang S Y，Yun S I，Park H S，et al.Molecular characterization of PL97-1，the first Korean isolate ofthe porcine reproductive an⁃drespiratory syndrome virus.Virus Res，2004：104（2）：165-179.

[7] Yoon S H，Song J Y，Lee C H，et al . Genetic characterization of the Korean porcine reproductive and respiratory syndrome viruses⁃based on the nucleocapsid protein gene（ORF7）sequences[J].Arch Virol，2008，153（4）：627-635.

[8] Hao X，Lu Z，Kuang W，et al.Polymorphic genetic characteriza⁃tion of the ORF7 gene of porcine reproductive and respiratory syn⁃drome virus（PRRSV）in China.Virol J，2011，8：73.

Genetic variation of the ORF7 geneof porcinereproductiveand respiratory syndromevirus isolated in Fujian province

LIU Jian-kui，WEI Chun-hua，DAI Ai-ling，LI Xiao-hua，YANG Xiao-yan
（College of Life Sciences of Longyan University，Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine and Biotechnology，Engineering Research Center for the Prevention and Control of Zoonosis，Longyan 364000，China）

Abstract：To study the genetic diversity the molecular epidemiology and phylogenetic relationship of porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）in Fujian province the ORF7 gene from 12 PRRSV isolates isolated from 2009 to 2013 were sequenced and analyzed.The results showed that European type PRRS and American type PRRS existed in Fujian.Ten isolates be⁃longed to PRRSV American type shared 89.5%～100%amino acids identity with other American type PRRSV reference strains，but shared only 59.5%～63.6% identity with LV strain.Two isolates belonged to PRRSV European type shared 91.4% and 92.2% amino acids identity with LV respectively，but shared only 60.3%～64.5% identity with other American type PRRSV reference strains.Although there is variation in the N protein of the American strain, it is relatively conserved among strains in Fujian.

Key words：PRRSV；ORF7 gene；Genetic variation

通讯作者：杨小燕，E-mail：lyyxy1988@126.com

作者简介：刘建奎（1982-），男，实验师，硕士，主要从事分子病原学研究，E-mail：liujiankui99@126.com

基金项目：福建省自然科学基金（2011J01233）；龙岩学院百名青年教师攀登项目（LQ2013022）

收稿日期：2014-07-15

中图分类号：S852.65+1

文献标志码：A

文章编号：0529- 6005（2015）10- 0017- 03