刘婷婷，谢芝勋，宋德贵，罗思思，谢丽基，李　孟，谢志勤，邓显文（.广西师范大学生命科学学院，广西桂林54000；.广西兽医研究所广西畜禽疫苗新技术重点实验室，广西南宁53000）

H3亚型禽流感病毒二温式RT- PCR检测方法的建立及初步应用

刘婷婷1，谢芝勋2，宋德贵1，罗思思2，谢丽基2，李孟2，谢志勤2，邓显文2
（1.广西师范大学生命科学学院，广西桂林541000；
2.广西兽医研究所广西畜禽疫苗新技术重点实验室，广西南宁530001）

摘要：为建立快速、准确检测H3亚型禽流感病毒（AIV）的方法，根据GenBank中H3亚型AIV HA基因序列，设计出1对特异性引物，通过优化反应条件建立了H3亚型AIV二温式RT-PCR检测方法。对该法进行特异性、敏感性检测，并对256份临床样品进行检测。结果表明，该法只能扩增H3亚型AIV，对其他亚型AIV及常见禽病病原体不扩增；对H3亚型AIV检测下限为1×104拷贝/μL；256份临床样品检测结果与病毒分离鉴定结果一致。与普通RT-PCR相比该法节省了30 min，表明所建立的H3亚型AIV二温式RT-PCR方法是一种快速、简便和特异的检测方法。

关键词：H3亚型AIV；二温式RT-PCR；检测

Corresponding author：XIE Zhi-xun

禽流感（Avian influenza，AI）是由正黏病毒科流感病毒属A型流感病毒引起的家禽及野生禽类感染及疾病的总称[1]，其感染范围很广，几乎所有的野生及家养禽类均可感染。根据AIV的致病性强弱可分为高致病性和低致病性AIV，以H5N1、H7N7亚型毒株为代表的高致病性AIV可以感染人并致人死亡。低致病性AIV在禽类体内只表现轻微症状或不发病，往往不引起人们的广泛关注，直至1999年的香港H9N2亚型AIV感染人的事件才引起世界对低致病性AIV的关注。越来越多的研究报道表明，低致病性AIV可为高致病性AIV提供基因片段造成对人类的感染[2]。H3亚型AIV为低致病性AIV，在家禽中分离率较高且在不同家禽中分布的季节性与我国人群中流感病毒流行的季节性比较一致[3-4]，这为禽-人两种宿主的流感病毒在猪这个“混合器”中发生基因重组提供了条件。1968年暴发的香港流感病毒A/HongKong/68（H3N2）经研究证实就是由人的H2N2亚型流感病毒与H3亚型AIV的HA基因重组得来[5]。因此，加强对H3亚型AIV的监测对养禽业和公共卫生都有重要意义。长期以来，针对AIV的检测主要依靠传统血清学，耗时费力，具有一定的局限性。二温式RTPCR是根据常规RT-PCR技术原理改进而成，其将退火和延伸合并为同一个温度，即变性和退火-延伸温度，增强了扩增产物的特异性。因此二温式RT-PCR是一种简单、快速、特异的技术，但至今未见有二温式RT-PCR检测H3亚型AIV的报道。为此，本研究针对H3亚型AIV设计了二温式RT-PCR检测方法，旨在为H3亚型AIV感染的诊断提供快速、简便的方法。

1　材料与方法

1.1毒株H1、H3、H4、H6、H9亚型AIV由本实验室分离鉴定，H5、H7亚型AIV RNA为美国宾夕法尼亚州立大学禽病诊断研究室惠赠，新城疫病毒（NDV）F48E9株、传染性支气管炎病毒（IBV）H52株、传染性喉气管炎病毒（ILTV）北京株、鸡毒支原体（MG）S6株及禽呼肠孤病毒（ARV）S1733株由本实验室保存。

1.2试剂DNA/RNA抽提试剂盒、AMV反转录酶、5×AMV Buffer、dNTP、RNA酶抑制剂、pMD-18T载体，均购自TaKaRa公司；质粒小量提取试剂盒、胶回收试剂盒，购自广州东盛生物科技有限公司；2×Taq PCR Master Mix，购自Invitrogen公司。

1.3其他SPF鸡胚，购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司；PCR仪为美国Perkin Elmer Cetus公司生产的PE9600仪。

1.4引物设计与合成根据GenBank中H3亚型AIV HA基因的保守核苷酸序列，利用Primer 5.0软件以已上传的H3序列为模板（登录号：CY100443）设计合成1对特异性引物，由Invitrogen公司合成。引物序列信息如表1。

表1　引物序列信息

1.5病毒RNA抽提与反转录参照DNA/RNA抽提试剂盒说明书抽提ILTV、MG的DNA，同时提取各亚型AIV及NDV、IBV和ARV的RNA，并用随机引物（9mer）进行反转录,将反转录的cDNA，置-30℃保存备用。

1.6标准品的制备对H3亚型AIV HA基因全长进行PCR扩增并进行胶回收，将回收产物连接至pMD-18T载体，转化大肠杆菌感受态细胞，挑取转化平板上的重组菌，提取重组菌质粒，经PCR鉴定，并将阳性的克隆质粒送至Invitrogen公司进行序列测定。

1.7二温式PCR条件的优化采用25 μL反应体系：12.5 μL 2×PCR Master Mix、0.5 μL 25 pmol/μL引物H3-F和H3-R、2 μL cDNA、以ddH2O补足25 μL，瞬时离心。根据引物Tm值，将退火温度按60℃～68℃依次递增，经多次重复试验确定最佳退火温度。

1.8二温式PCR的特异性试验利用本研究优化后的二温式PCR反应体系，扩增5株分离的H3亚型AIV核苷酸作为阳性对照，同时扩增H1、H4、H5、H6、H7、H9亚型AIV、NDV、IBV、ILTV、MG、和ARV的核苷酸，检测其特异性。

1.9二温式PCR的敏感性试验对H3亚型AIV HA基因测序正确的质粒标准品进行10倍倍比稀释，使其浓度为1×107～1×102拷贝/μL，用二温式RT-PCR方法分别对1×107～1×102拷贝/μL质粒标准品进行扩增，用1.5%琼脂糖凝胶电泳观察该方法敏感度。

1.10临床样品检测对256份（其中鸡、鸭、鹅和鸽子分别为63、98、46、49份)从广西南宁市活禽市场采集的咽喉和泄殖腔拭子反复挤压、清洗，从中抽提病毒RNA并反转录为cDNA，用所建立的二温式RT-PCR方法进行检测。同时对这256份样品进行抗生素处理后，用鸡胚法分离病毒，通过HA、HI试验验证该方法的准确性。

2　结果与分析

2.1二温式PCR条件的优化通过对二温式PCR反应条件的优化，确定PCR反应模式为：94℃4 min；94℃40 s，65℃50 s，35个循环；72℃延伸10 min，4℃结束。其PCR反应产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

2.2特异性试验特异性试验结果显示，只有H3亚型AIV有特异性条带出现，大小为548 bp，与预期结果一致（图1）；而其他亚型AIV和禽呼吸道疾病病毒均未扩增出对应条带，说明该方法特异性强。

2.3敏感性试验利用本研究优化好的二温式RT-PCR反应条件对浓度为1×107～1×102拷贝/μL 的H3亚型AIV标准品进行扩增，如图2所示，1× 107～1×104拷贝/μL的H3亚型AIV标准品出现明显扩增条带，片段大小与预期结果一致，表明本研究建立的H3亚型AIV二温式RT-PCR检测方法最低能检测到1×104拷贝/μL H3亚型AIV。

图1　二温式RT- PCR的特异性试验结果

图2　二温式PCR的敏感性试验结果

2.4临床样品检测在广西南宁市256份活禽市场样品中，二温式RT-PCR检测结果有19份呈现H3亚型AIV阳性；病毒分离鉴定结果为19份阳性样品。表明所建立的二温式RT-PCR检测结果与病毒分离鉴定结果一致。图3为部分临床样品检测结果。

图3　部分临床样品检测结果

3　讨论

AIV是分节段的病毒，由于RNA聚合酶保真性低，其基因组变异率很高，当同一宿主同时感染多种亚型的AIV，不同毒株间可能会发生基因片段的重组，产生新的AIV亚型的病毒，其对人类的危害不可预测。H3亚型AIV是低致病性的，在水禽身上隐性携带，并未引起人们的广泛关注，但有研究表明，H3亚型AIV可能跨越种属屏障直接感染人[9-10]，因此，建立一种针对H3亚型AIV的快速、准确的检测方法显得十分必要。

本研究二温式RT-PCR是在普通RT-PCR基本原理基础上建立的，并参考相关文献优化了反应条件[11-13]。与常规RT-PCR相比，本研究所建立的二温式RT-PCR方法节省约30 min；特异性试验表明，该二温式RT-PCR只能扩增出H3亚型AIV，而对其他亚型AIV及其他禽呼吸道疾病病原体不扩增，具有高度特异性；敏感性试验也表明该方法高度敏感，能检测到1×104拷贝/μL的质粒；临床样品检测结果与病毒分离鉴定结果一致，证明了该方法的有效实用性。因此本研究所建立的H3亚型AIV二温式PCR方法具有简便、快速、特异性好、灵敏度高等特点，为H3亚型AIV快速检测提供了新方法。

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Dule- temperature RT- PCR for diagnosis of H3 Subtype Avian Influenza Virus

LIU Ting-ting1，XIE Zhi-xun2，SONG De-gui1，LUO Si-si2，XIE Li-ji2，LI Meng2，XIE Zhi-qin2，DENG Xian-wen2
（1.Guangxi Normal University，College of life science，Guilin 541000，China；2.Guangxi Veterinary
Research Institute，Guangxi Key Laboratory of Animal Vaccines and New Technology，Nanning 530001，China）

Abstract：In order to establish a rapid and accurate method to detect H3 subtype avian influenza virus（AIV），a pair of specif⁃ic primer were designed according to the sequences of the hemagglutinin（HA）genes of H3 subtype AIV in GenBank.Then the re⁃action conditions were optimized and a Dule-temperature RT-PCR was established.The results showed that this Dule-temperature RT-PCR was only specific for the H3 subtype AIV without amplification of the other viruses.The detection limit of Dule-tempera⁃ture RT-PCR was 1×104copies/uL.Clinical samples test were accorded with the viral isolation completely.The detection time was reduced about 30 min than the routine PCR.These results indicated the method is rapid，simple and specific for the detection of H3 subtype AIV.

Key words：H3 subtype AIV；dule-temperature PCR；detection

通讯作者：谢芝勋，E-mail：xiezhixun@126.com

作者简介：刘婷婷（1988-），女，硕士，研究方向为动物生态学，E-mail：lttyy8849@163.com

基金项目：广西特聘专家专项经费（2011B020）；广西科技攻关重大专项（1222003-2-4）；广西畜禽疫苗新技术重点实验室项目（13-051-27-A-2）；广西基本科研业务费专项（14-1）共同资助

收稿日期：2014-07-23

中图分类号：S854.43

文献标志码：A

文章编号：0529- 6005（2015）10- 0014- 03