李　然,赖钟雄,赖呈纯,方智振,林玉玲,刘生财,陈裕坤,张梓浩

(福建农林大学 园艺植物生物工程研究所,福州 350002)



龙眼松散型胚性愈伤组织发生过程中相关蛋白的表达分析

李然,赖钟雄*,赖呈纯,方智振,林玉玲,刘生财,陈裕坤,张梓浩

(福建农林大学 园艺植物生物工程研究所,福州 350002)

摘要:以龙眼‘红核子’品种(DimocarpuslonganLour.cv.Honghezi)松散型胚性愈伤组织(FEC)为材料,采用固相双向凝胶电泳技术和质谱鉴定技术,对其生长过程中相关蛋白的表达变化进行研究。结果表明:(1)龙眼FEC生长过程中,总蛋白点数在400～800之间,蛋白点数变化虽有升降起伏,但总体呈上升趋势;蛋白质pI集中在4～7之间;蛋白质分子量在14～97 kD之间,表达量相对较高的是分子量在30～66 kD的蛋白质,且30～45 kD的蛋白点逐渐增多,45～66 kD的逐渐减少。(2)龙眼FEC生长过程中质谱鉴定66个蛋白,其中28.79%为功能未知蛋白,30.30%涉及胁迫应答和抗氧化,10.61%涉及能量和糖代谢,10.61%涉及蛋白代谢和修复,6.06%涉及细胞骨架重构,4.55%蛋白是调控蛋白,3.03%是核酸代谢相关蛋白,而所占比例最少的为信号转导与细胞凋亡相关蛋白、氨基酸代谢相关蛋白、脂类代谢相关蛋白,以及维生素代谢相关蛋白均为1.52%。(3)龙眼FEC生长过程中,胁迫反应/氧化还原相关蛋白(抗坏血酸类过氧化物酶R147、R158和HC21,苄基醚还原酶同系物TH6、谷胱甘肽过氧化酶以及过氧化物酶L26)表达高峰出现在前期10～20 d,而过氧化物酶4多在后期40～50 d表达;蛋白质合成及修复的相关蛋白,只有蛋白质异形体1在10～30 d表达量高,其他蛋白的表达高峰出现在前期10～20 d之间,能量与糖代谢相关酶在整个过程中都有较大量的表达。

关键词:龙眼;松散型胚性愈伤组织;蛋白质组;质谱

龙眼((DimocarpuslonganLour.)胚胎发育状况关系到成熟果实的食用和加工甚至坐果率,尤其是早期败育的品种普遍存在严重的生理落果问题,直接影响到产量。植物体细胞胚在发生发育中与合子胚胎发育过程相似[1],因此,阐明龙眼体胚发生发育过程从基因到性状表达的规律有着十分重要的意义,可为新品种选育、果核大小调控、果实品质改善以及提高坐果率、增加产量提供理论依据[2]。已建立并长期保持的龙眼松散型胚性愈伤组织(friable embryogenic callus,FEC),具有很强的体细胞胚发生和植株再生能力,这在木本植物中是很少见的,是木本植物离体胚胎发生的模式植物之一[3-5]。龙眼FEC及其悬浮细胞系,是分离原生质体的优良材料,是用于基因工程育种的良好转化体系,是细胞突变体筛选的高效试验系统,在快速繁殖苗木、制作人工种子等方面龙眼的胚性细胞系也是一种优良体系[3]。前人研究表明,龙眼体细胞胚发生各时期的主要蛋白质组分相似,体现了体胚蛋白质组分的稳定性,也说明这些蛋白质是维持体胚细胞基础代谢必需基因表达的产物[6]。因此找出胚性愈伤组织和胚状体特异蛋白之间的联系及功能,对于深入了解体胚发生机理有重要意义。通过对龙眼体细胞胚发生早期[7]、中期[8]和后期[9]蛋白质组学以及相关分子生物学方面[10]的研究,发现龙眼体胚发生的整个过程是受内外环境综合影响,包括激素种类和浓度的调节、大分子物质代谢与积累、氧化胁迫等,导致不同阶段蛋白质(包括酶)组分及含量的不同,与衰老有关的酶系统,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)是生物体内氧自由基清除系统的三大重要酶系,随机体衰老会大量积累。龙眼FEC高频率体细胞胚发生和再生能力的保持,与其长期继代保持过程中细胞活力的维持息息相关。因此利用蛋白质组学方法研究龙眼FEC衰老过程中蛋白质的功能,从蛋白质水平上探讨龙眼FEC生长和衰老机制,为龙眼FEC正常培养、长期继代以及胚性保持提供依据。

1材料和方法

1.1供试材料

龙眼LC2细胞系的松散型胚性愈伤组织[3],于附加1.0 mg/L 2,4-D的MS固体培养基上继代培养,温度(25±2) ℃,黑暗培养。分别取培养10、20、30、40和50 d的FEC后作为试验材料。第一向电泳采用Ettan IPGphor Ⅲ等电聚焦系统;第二向电泳采用Ettan DALTsix垂直电泳系统。蛋白质组试验所用试剂均为GE Healthcare生产,其他化学试剂为国产分析纯。

1.2方法

1.2.1蛋白质样品的提取与定量龙眼FEC不同培养阶段丙酮干粉制备和蛋白样品的提取参照赖呈纯等[11]的方法。提取的蛋白质样品参照Bradford[12]稍作改良的方法进行定量。

1.2.2蛋白质样品双向电泳第一向等电聚焦(IEF)电泳和IPG胶条平衡,采用线性IPG胶条长度18 cm,pH为4～7,使用Ettan IPGphor Ⅲ(GE Healthcare),采用主动加样水化。固相pH梯度凝胶第二向SDS-PAGE采用GE Healthcare公司生产的Ettan DALTsix垂直电泳系统进行,具体参数和操作方法见赖呈纯等[7]和方智振等[8]的方法。

1.2.3龙眼胚性愈伤组织生长过程中相关蛋白的质谱鉴定将选好的目的蛋白点,用解剖刀沿蛋白点染色边缘切下,装入1.5 mL EP管中,做好标记,交由上海复旦大学生物质谱实验室,用MALDI-TOF质谱仪制备肽质量指纹谱,鉴定蛋白具体操作参照赖呈纯等[7]的方法。

2结果与分析

2.1质谱鉴定的龙眼相关蛋白点在双向电泳凝胶上的分布及相关信息

龙眼FEC凝胶2-D图谱分析后,选取蛋白表达量相对值超过0.3的74个差异表达蛋白进行质谱鉴定,由于其中18个点在本实验室其他研究[7-9]中已经完成鉴定,本实验不再重复。对剩下56个差异表达的蛋白点进行质谱鉴定,鉴定成功的有48个(图1中绿色显示,且在图1和表1中用编号R表示),其蛋白匹配分数大于72,得到的数据库搜索结果较为可靠。

2.2质谱鉴定相关蛋白的功能分析

对龙眼松散型胚性愈伤组织生长过程中差异显著的56个蛋白进行MALDI-TOF质谱分析,成功鉴定48个点(匹配分数≥72),成功率达到85.71%。可见利用MALDI-MS方法鉴定蛋白质,尤其对于混合蛋白质多肽类物质相对分子质量的精确测定有很大优势[13]。加上何园[9]和赖呈纯等[7]已鉴定的18个蛋白(表2中编号分别为HC和L的蛋白点),龙眼FEC生长过程中已经成功鉴定的点总共有66个,可以分为11个功能类群(表2),分别是胁迫应答和抗氧化相关蛋白、蛋白代谢和修复相关蛋白、能量和糖代谢相关蛋白、信号转导和细胞凋亡相关蛋白、核酸代谢相关蛋白、细胞骨架的重构相关蛋白、维生素代谢相关蛋白、脂类代谢相关蛋白、氨基酸代谢相关蛋白、调控蛋白以及功能未知蛋白。其中,在已知功能的蛋白中,比例最高的是胁迫应答和抗氧化相关蛋白,占30.30%,并且过氧化物酶数量最多,有12个;其次是蛋白代谢和修复相关蛋白以及能量和糖代谢相关蛋白,都有7个,分别都占10.61%;细胞骨架的重构相关蛋白,所占比例是6.06%;调控蛋白共有3个,比例占到4.55%;核酸代谢相关蛋白有2个,占3.03%;占比例较少的为维生素代谢、氨基酸代谢、脂类代谢相关蛋白信号转导相关蛋白,分别只有1个,各占1.52%。其余还有19个功能未知蛋白在数据库中检索不到得分大于72的结果,可能是目前像龙眼这样的木本植物在分子方面的研究还很有限。在龙眼松散型胚性愈伤组织生长过程中参与氧自由基清除功能的酶占了功能已知蛋白的一半以上,可以推测在生长过程中不同阶段,会有不同的酶出现维持细胞内部的氧化胁迫压力平衡,从而保证正常生长增值。

2.3龙眼松散型胚性愈伤组织生长过程中质谱鉴定蛋白表达变化

2.3.1胁迫应答和抗氧化相关蛋白龙眼FEC生长过程中鉴定出的胁迫应答和抗氧化类相关蛋白共有20个,以过氧化物酶为主,其中苄基醚还原同系物TH6、谷胱甘肽过氧化酶、过氧化氧化还原蛋白各1个,抗坏血酸类过氧化物酶共5个,其余12个全部为过氧化物酶,其中两个过氧化酶(HC19和L26)通过数据库检测是同一个蛋白(登录号均为gi|218328),其他均为过氧化酶4。不同种类过氧化物酶表达量增加的阶段也不同,表达量相对值超过0.3,前期(10～20 d)表达的主要有6个:抗坏血酸类过氧化物酶R147、R158和HC21,苄基醚还原酶同系物TH6,谷胱甘肽过氧化酶以及过氧化物酶L26。在培养10 d时主要是苄基醚还原酶同系物TH6和叶绿体抗坏血酸类过氧化物酶HC21,20 d时苄基醚还原酶同系物TH6的表达量虽然有所下降但仍然高于0.3,其余3种表达量由高到低依次是抗坏血酸类过氧化物酶R147、抗坏血酸类过氧化物酶R158、谷胱甘肽过氧化酶、过氧化酶L26。到生长中期(30 d)6种酶的表达量都有所下降,而过氧化还原蛋白的表达量超过他们,过氧化物酶4 R248、R261、R264都有少量表达。在后期(40～50 d)大量表达的是全部的过氧化酶(过氧化酶4和过氧化酶HC19)以及2种抗坏血酸类过氧化物酶(R361和细胞质抗坏血酸类过氧化物酶1),表达量最高的是过氧化物酶4 R248,谷胱甘肽过氧化酶和过氧化还原蛋白还有少量表达(表达量相对值小于0.2),到50 d时,部分过氧化物酶表达量下降或消失,但抗坏血酸类过氧化物酶R361表达量还很高(表3)。可见,在龙眼松散型胚性愈伤组织生长过程的不同阶段,会有不同的抗氧化相关蛋白起主要作用,行使平衡氧胁迫环境及清除氧自由基的功能。

图1　龙眼FEC质谱鉴定的相关蛋白点在双向电泳凝胶上分布

表2　质谱鉴定蛋白分类

功能分类Functionalelassification数量Number比例Proportion/%蛋白编号Proteincode胁迫应答和抗氧化Stressresponseandantioxidant2030.30HC21、HC19、L26、R41、R147、R158、R160、R248、R261、R264、R265、R289、R291、R300、R305、R307、R336、R354、R361、R389蛋白代谢和修复Proteinmetabolismandrepair710.61HC40、R2、R18、R95、R150、R195、R42能量和糖代谢Energyandglucosemetabolism710.61HC8、L5、L70、R8、R149、R284、R315信号转导与细胞凋亡Signaltransductionandcellapoptosis11.52L1细胞骨架的重构Thereconstructionofthecytoskeleton46.06HC29、L12、R217、R244调控蛋白Regulatoryprotein34.55L7、L34、L49氨基酸代谢Aminoacidmetabolism11.52HC7脂类代谢Lipidmetabolism11.52HC18核酸代谢Nucleicacidmetabolism23.03R179、R215维生素代谢Vitaminsmetabolism11.52R216未知蛋白Unknownprotein1928.79HC1、HC11、HC24、R5、R52、R60、R65、R71、R73、R167、R169、R177、R189、R203、R252、R257、R265、R266、R312、R355

2.3.2蛋白代谢和修复相关蛋白龙眼FEC生长过程中共鉴定到蛋白代谢和修复相关酶7个。在生长前期,细胞分裂迅速,愈伤组织体积和重量生长也非常迅速,即前期(10～20 d)是龙眼FEC快速增殖期,因此,此时也很可能是蛋白质大量合成并行使功能的主要时期。此时与蛋白质合成及修复相关的蛋白就会大量表达,主要有4种,分别是二硫化物异构酶、延伸因子类似蛋白、GTP结合蛋白和蛋白质异形体1,且表达量最高的是二硫化物异构酶,最低的是GTP结合蛋白。在培养20 d时,蛋白酶体β亚基7、10和α亚基也有表达,且蛋白表达相对值超过0.3。到生长30 d时,只有蛋白质异形体1表达量升高,其余都降低或者消失。而到生长后期(40～50 d)各种蛋白合成及修复的相关酶已经不表达或者很少,只有蛋白酶体α亚基和60s酸性核糖体蛋白还有少量表达,表达量百分含量低于0.3(图2)。表明在龙眼FEC生长后期细胞渐渐衰老,生命力减弱。

2.3.3能量和糖代谢相关蛋白在龙眼松散型胚性愈伤组织生长的整个过程中,为各种生命活动提供能量是必不可少的,因此能量代谢一直贯穿于生长到衰老的整个过程中。不同的与能量和糖代谢相关的酶参与了不同的生理活动。已经鉴定出的7种能量与糖代谢相关蛋白在龙眼FEC整个生长过程中表达量都很高,在培养10 d时RuBisCo大亚基结合蛋白β亚基和2个烯醇化酶的表达量很高,到培养20 d时磷酸甘油酸酯激酶和烯醇化酶HC8的表达量依然很高,最高达到1.0以上,到30 d时NAD-苹果酸脱氢酶也表现出了相对高的表达量,到后期线粒体F1-ATP酶β亚基、烯醇化酶和磷酸丙糖异构酶Ⅱ表达量还是比较高,直到50 d时磷酸丙糖异构酶Ⅱ还有大量表达(图3)。

2.3.4核酸代谢相关蛋白龙眼松散型胚性愈伤组织生长过程相关蛋白的质谱鉴定结果中,有两个核酸代谢相关蛋白,这两种蛋白的表达量趋势基本相似,大量表达都集中在培养30 d时,且二磷酸核苷激酶的表达量最高,超过1.4,其次是转录辅助蛋白,在20和40 d时二磷酸核苷激酶也有表达。可能在此阶段有相关核酸蛋白的合成,而使核酸代谢相关蛋白大量表达(图4)。

表3　龙眼松散型胚性愈伤组织生长过程中胁迫应答和抗氧化类群蛋白表达变化模式

图2　龙眼松散型胚性愈伤组织生长过程中

2.3.5细胞骨架的重构相关蛋白肌动蛋白和肌球蛋白以及微管蛋白都是细胞骨架的主要成分,为细胞质流动、细胞器运动、物质运输、有丝分裂、胞质分裂和细胞的顶端生长等提供所需的力。在龙眼FEC生长过程中,质谱鉴定成功的蛋白包含肌动蛋白、Ⅱ类重链肌球蛋白、类肌球蛋白以及α-微管蛋白各1个,并且都是在培养30 d时有大量表达,且Ⅱ类重链肌球蛋白的表达更多。可能与此时期细胞生理活动发生变化有关(图5)。

图3　龙眼松散型胚性愈伤组织生长过程中

图4　龙眼松散型胚性愈伤组织生长过程中

图5　龙眼松散型胚性愈伤组织生长过程中

2.3.6调控蛋白龙眼FEC生长过程中共有3个调控蛋白,在赖呈纯等[7]的研究中已鉴定出来,分别是α多肽类似蛋白3、逆转录转座子蛋白、肌动蛋白结合蛋白,龙眼FEC生长过程中主要集中在20～30 d表达(图6),表达量由高到低依次是逆转录转座子蛋白、α多肽类似蛋白3、肌动蛋白结合蛋白,且肌动蛋白结合蛋白开始表达的时间要比肌动蛋白表达的时间提前(图5和图6),可能肌动蛋白结合蛋白的主要作用是调控后续肌动蛋白等相关表达。

2.3.7信号转导与氨基酸、维生素、脂类代谢相关蛋白龙眼FEC生长过程中质谱鉴定到信号转导与细胞凋亡相关蛋白、氨基酸代谢相关蛋白、维生素代谢相关蛋白和脂类代谢相关蛋白各有一个,分别为S-腺苷甲硫氨酸合成酶、雷帕霉素靶蛋白激酶、胞质型的半胱氨酸合成酶7和烟草烯脂酰-ACP还原酶,并且除S-腺苷甲硫氨酸合成酶在30 d时有大量表达,其他主要都是在40 d时可以检测到表达,雷帕霉素靶蛋白激酶在50 d时有少量表达(图7) 。S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine,SAM)是人体和其他生物体内的主要甲基供体(它为体内蛋白质、脂肪、核糖核酸和维生素B12提供甲基),也是多胺代谢中的重要合成前体,其他代谢相关蛋白在后期表达可能是进入衰老阶段时,主要靠这些酶来维持基础代谢。

图6　龙眼松散型胚性愈伤组织生长

图7　龙眼松散型胚性愈伤组织生长过程中信号

3讨论

3.1能量和糖代谢是龙眼松散型胚性愈伤组织生长的基础

在龙眼FEC生长的整个过程中(培养0～50 d),质谱鉴定成功的能量代谢相关蛋白共有7个,包括2个烯醇化酶,NAD-苹果酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶Ⅱ、磷酸甘油酸酯激酶、RuBisCO大亚基结合蛋白β亚基、线粒体F1-ATP酶β亚基各1个。NAD-苹果酸脱氢酶是三羧酸循环过程中的关键酶、三羧酸循环是依赖氧气的供能方式。烯醇化酶、磷酸丙糖异构酶Ⅱ、磷酸甘油酸酯激酶都参与糖酵解,是糖酵解过程重要的几个酶。糖酵解是在氧气不足条件下,将葡萄糖或糖原分解为乳酸,并释放少量ATP的过程。RuBisCO有双重调节功能,在CO2浓度高时起羧化作用,而在O2浓度高时起加氧作用。ATP酶催化ATP转化成ADP释放能量是细胞生命活动最直接的能量来源。

龙眼FEC生长过程早期(10～20 d)表达的酶有烯醇化酶、NAD-苹果酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶Ⅱ、磷酸甘油酸酯激酶及RuBisCO大亚基结合蛋白β亚基。RuBisCO大亚基结合蛋白β亚基在10～30 d的表达量逐渐下降,可能是在早期细胞增值快,细胞活性高,呼吸作用强烈,在狭小的空间里氧气会供应不足,RuBisCO可以适当平衡CO2/O2浓度,保证呼吸作用正常进行,并且由于氧气缺乏,细胞主要以糖酵解-三羧酸循环方式供能,以促进快速生长。烯醇化酶催化从2-磷酸甘油酸形成高能化合物磷酸烯醇式丙酮酸的酶,两种烯醇化酶HC8和L70分别在生长早期开始大量表达且分别在30 d和40 d时表达量最高,可能主要与其参与糖酵解过程有关。胞质型磷酸甘油酸酯激酶(cytosolic phosphoglycerate kinase,PGK)几乎存在于所有的生物中,并且高度保守[14]。其表达量在生长20 d时最高,在30 d之后逐渐下降,与其功能相关,它也是参与糖酵解的重要酶,可以催化ATP和ADP之间的转化,实现能量之间的传递。

磷酸丙糖异构酶Ⅱ主要在后期(40～50 d)表达,并且呈上升趋势,说明到后期可能由于氧气的缺乏主要以糖酵解过程为主提供胚性愈伤组织生长发育所需要的能量消耗。ATP酶又称为三磷酸腺苷酶,是一类能催化三磷酸腺苷(ATP)水解为二磷酸腺苷(ADP)和磷酸根离子的酶,并且释放能量。在龙眼愈伤组织生长30 d时检测到表达,且到40 d时,检测到线粒体F1-ATP酶β亚基的大量表达。在龙眼体细胞胚发生过程中,也检测到该酶转录水平的规律变化[15]。线粒体内膜的内表面有直径为90埃的球状颗粒一般被称为偶联因子1(F1),F1有ATP酶活力,缺失F1的线粒体内膜制剂会失去氧化磷酸化能力,加入F1则可恢复此能力。可见线粒体F1-ATP酶β亚基对构成完整的ATP酶并保证其活力有重要意义。

3.2蛋白质合成与修复是保证龙眼松散型胚性愈伤组织正常生长的物质基础

蛋白质是一切生命的物质基础,是机体细胞的重要组成部分。不同的结构和性状可以构成功能不同的蛋白质。蛋白质可以参与基因表达的调节,以及细胞中氧化还原、电子传递、神经传递乃至学习和记忆等多种生命活动的过程。尤其在生命活动旺盛的细胞中更需要蛋白质的参与,所以蛋白质的大量合成也多发生在细胞活力旺盛的细胞中。

龙眼FEC生长早期有多种蛋白质合成相关酶的表达,鉴定到的有7个,分别是二硫化物异构酶、延伸因子类似蛋白、蛋白质异形体1、蛋白酶体两类亚基、酸性核糖蛋白。从整体表达趋势来看以早期大量表达为主,后期也有蛋白酶体和酸性核糖蛋白的表达,但是表达量很少。在龙眼FEC生长到10 d时二硫化物异构酶、延伸因子类似蛋白、蛋白质异形体1、GTP结合蛋白都拥有最高表达量,除蛋白质异形体1在40 d时降到最低点,其他都在30 d时表达量就降到最低。

GTP结合蛋白(GTP binding protein,G蛋白),与GTP或GDP结合的蛋白质,又叫鸟苷酸结合调节蛋白(guanine nucleotide-binding regulatory protein),它参与细胞的多种生命活动,如细胞通讯、核糖体与内质网的结合、小泡运输、蛋白质合成等。在龙眼FEC生长早期鉴定到GTP结合蛋白的表达,推测与细胞快速增值时蛋白质合成、信号转导等需要有关。龙眼FEC生长10～30 d都有不同程度表达量推定的蛋白质异形体1(hypothetical protein isoform 1),且以10 d时表达量最高。蛋白质异形体(protein isoform)是一些功能上相关,而结构不同的蛋白质形式。例如由同种mRNA前体经可变剪接可以产生功能相关的不同蛋白质。延伸因子(elongation factor,EF)是参与蛋白合成过程中肽链延伸的蛋白因子,在蛋白质合成过程中,帮助进入的氨基酸残基与肽链之间形成酰基,使肽链得以延长。延伸因子类似蛋白(elongation factor-like prote)在龙眼胚性愈伤组织生长前期被发现有表达,可能与快速生长时蛋白质的大量合成有关。二硫化物异构酶(disulfide isomerase)是存在于真核生物细胞质网状结构的一种酶,它可以催化形成或断裂蛋白质半胱氨酸残基之间的二硫键,以保证蛋白质能迅速而准确地完成折叠。二硫化物异构酶在蛋白质折叠中扮演着重要角色[16]。

在龙眼FEC生长过程中发现了蛋白酶体的两类亚基,蛋白酶体α亚基和β亚基7、10,都是在组织培养20 d时有大量的表达。蛋白酶体是存在于胞质溶胶中的一类结构和功能保守的蛋白酶解复合物,在真核生物和古菌中普遍存在的,蛋白酶体是细胞用来调控特定蛋白质和除去错误折叠蛋白质的主要机制。经过蛋白酶体的降解,蛋白质被切割为约7～8个氨基酸的肽段;这些肽段可以被进一步降解为单个氨基酸分子,然后被用于合成新的蛋白质。

从不同酶不同时间的表达可以看出10～20 d是龙眼FEC快速生长增值的阶段,到30 d时表达量开始下降,可能是一个转折期,后期表达量和酶的种类都减少,可能细胞的生长渐趋缓慢甚至停止。因此继代培养或者用于做细胞培养时,龙眼FEC最晚取20 d时的材料。

3.3细胞骨架和调控蛋白是维持龙眼松散型胚性愈伤组织生命活动的重要物质

在龙眼FEC生长旺盛的中期鉴定到4种与细胞骨架重构相关的蛋白和3种调控相关蛋白,都在20～30 d有大量表达,之后便逐渐减少。此时表达的Ⅱ类重链肌球蛋白(myosin class Ⅱ heavy chain)、类肌球蛋白XIC(myosin-like protein XIC)、肌动蛋白、α-微管蛋白都是构成细胞骨架系统的主要成分,在细胞运动、细胞分裂、受精作用、基因表达和信息传递、能量转换以及维持细胞形态等方面都具有重要作用。

而3种调控相关蛋白:新生多肽相关复合物α亚基类似蛋白3(Alpha-NAC-like protein 3)、逆转录转座子蛋白及肌动蛋白结合蛋白均为赖呈纯等[7]鉴定得到的。逆转录转座子在植物中作为核DNA的主要组分含量丰富,玉米49%～78%的基因组由逆转录转座子构成[17]。小麦基因组68%是转座子[18]。转录转座子蛋白则与逆转录转座子的RNA、蛋白质的产生及包装成适当的形状以整合到基因组中有关[19]。肌动蛋白结合蛋白是一类调节肌动蛋白聚合、成束或交联的蛋白质,能将肌动蛋白丝与细胞浆和细胞膜的其他成分相连接[20],从而介导细胞形态的维持、细胞运动等众多生物学功能[21]。

新生多肽相关复合物α亚基类似蛋白与转录调控蛋白有相似的序列,且报道有催化加强c-Jun-mediated的转录的功能,在荔枝体胚发生初期[22]和龙眼体胚发生早期[7]都能检测到它的大量表达,但目前的研究对其生物学功能尚不能完全解释,推测其亚单位对基因的转录有调控作用[23]。

在龙眼FEC生长的旺盛时期,细胞骨架相关蛋白和调控蛋白的大量表达,对于细胞快速分裂,维持细胞形态以及运动等生命活动起到重要作用。

3.4从蛋白质水平解释龙眼松散型胚性愈伤组织的衰老机制

蛋白质是一切生命活动的体现者。蛋白质组是一个体系(包括细胞、亚细胞器、体液等)中的所有蛋白质,更能体现一个系统或组织的生命活动。从龙眼松散型胚性愈伤组织生长的不同阶段表达的蛋白质可以看出,主要是与细胞生长、分化、代谢、信号转导、细胞凋亡和抗逆性等功能相关,这充分反映了龙眼松散型胚性愈伤组织生长发育的生物学过程。

在成功鉴定的蛋白质中,有占鉴定成功的总蛋白数30.30%的蛋白与胁迫应答和抗氧化相关。12个过氧化物酶,三类抗坏血酸过氧化物酶(共5个),谷胱甘肽过氧化酶、过氧化氧化还原蛋白、苄基醚还原酶同系物TH6各1个。在龙眼FEC整个生长过程中的不同时期都有抗氧化相关酶的表达,在早期表达的有3个抗坏血酸过氧化物酶,苄基醚还原酶同系物TH6,可及时清除生理代谢过程中产生的氧自由基,维持细胞内氧化胁迫压力平衡。苄基醚还原酶可以催化异黄酮类和木酚素的生物合成,苄基醚还原酶同系物TH6,是催化异黄酮类和木酚素生物合成还原酶类的同系物[24],异黄酮和木酚素不仅能促进心材的快速生长,并且在植物防御方面也起到很大作用[25]。该酶在胚性愈伤组织培养10 d时就被检测到有大量表达,可能还与细胞生长及分化相关。

抗坏血酸过氧化物酶(APX)是利用抗坏血酸(AsA)为电子供体清除H2O2的一类酶。在鉴定成功的酶中,有3类抗坏血酸过氧化物酶:除抗坏血酸过氧化物酶外还有细胞质抗坏血酸类过氧化物酶1和类囊体结合抗坏血酸过氧化物酶,抗坏血酸过氧化物酶R147、R158和类囊体结合抗坏血酸过氧化物酶主要在前30 d内有大量表达,而之后主要表达的是抗坏血酸过氧化物酶R361和细胞质抗坏血酸类过氧化物酶1。可见在整个培养过程中从10～50 d都有不同的APX表达以发挥主要作用。

在中期过氧化氧化还原蛋白和两类抗坏血酸类过氧化物酶有少量表达,可能是细胞的生理状态开始发生改变,生长速度有所降低,细胞活力也开始下降,对胁迫也开始有应答,因此在此阶段表达的氧化胁迫酶种类和表达量都不高。而过氧化氧化还原蛋白(Prx)也是一种重要的氧自由基清除剂,研究证明寄生植物体内该酶是清除过氧化氢(H2O2)最重要的酶。Sayed等[26]对曼森吸血虫(Schistosomamansoni)Prx mRNAs的定量监控表明,在整个生活周期中Prx都有不同程度的表达,尤其以成熟期表达量最高。推定的prx-1、prx-2、prx-3在龙眼FEC生长后期有表达,可能主要参与清除氧自由基。

到后期随着细胞衰老的加剧,累积的氧自由基需要清除,表达出大量过氧化物酶4和两个抗坏血酸过氧化物酶来行使抗氧化延缓衰老的生理机制。过氧化物酶(POD)是存在于各种动物、植物和微生物体内的一类氧化酶。催化由过氧化氢参与的各种还原剂的氧化反应。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化,一般老化组织中活性较高,幼嫩组织中活性较弱。在龙眼FEC生长过程中共鉴定到12个过氧化物酶,也表现出在生长前期少量表达,主要集中在40～50 d时大量表达。这些过氧化物酶分别在不同的发育阶段起主导作用,以保持细胞内氧化胁迫压力平衡。对龙眼FEC生长过程中胁迫应答与抗氧化以及其他相关蛋白的研究,可以作为解决龙眼FEC长期继代过程中衰老问题的参考,为长期继代保存延缓衰老提供思路。

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(编辑:宋亚珍)

Analysis of Protein Expression during Growth Processes

of Friable Embryogenic Callus(FEC) of Longan

LI Ran,LAI Zhongxiong*,LAI Chengchun,FANG Zhizhen,LIN Yuling,

LIU Shengcai,CHEN Yukun,ZHANG Zihao

(Institute of Horticultural Biotechnology,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China)

Abstract:Using friable embryogenic callus(FEC) ofDimocarpuslonganLour.cv.Honghezi as the material,we carried out the proteomic analysis of its growth processes by using the immobilized pH gradients two-dimensional electrophoresis technology and matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry(MALDI-TOF/TOF).The results showed that:(1)The total protein was from 400 to 800 during longan FEC development,and it showed a rising trend in general although its variation trend had in fluctuation.Isoelectric point of all proteins was distributed between 4 and 7.Molecular weight of proteins of FEC during the normal development in longan was within 14-97 kD.The protein expression quantity was at relatively high within 30-66 kD,but within 30-45 kD it showed a rising trend and within 45-66 kD it showed a reverse trend.(2)Sixty-six proteins related to longan FEC development were identified.28.79% of the proteins were unknown identity or function,30.30% of the proteins participated in stress response and anti-oxidation,10.61% of the proteins were involved in energy and carbohydrate metabolism,10.61% of the proteins belonged to protein synthesis related,6.06% of the proteins were structural proteins involved in cytoskeleton remodeling,4.55% of the proteins were regulatory proteins,3.03% of the proteins were enzymes involved in nucleic acid metabolism.Additionally,1.52% of the proteins were associated with signal transduction and PCD,1.52% of the proteins were related to amino acid metabolism,1.52% of the proteins were lipid metabolism-related protein,and 1.52% of the proteins attached themselves to vitamin metabolism.(3)In the early stage(10-20 d),the expression of redox proteins associated with FEC in longan(including ascorbate peroxidase R147,R158 and HC21,phenylcoumaran benzylic ether reductase homolog TH6,glutathione peroxidase and peroxidase L26) was high,while the expression of peroxidase 4 was in late stage(40-50 d).Protein synthesis-related proteins showed a expression peak within 20 d,besides protein isoform 1 within 30 d.Different energy-associated proteins expressed more abundantly during whole period.There were S-adenosylmethionine synthetase(the enzyme related to precursors of polyamine) and a large number of peroxidase expression at the later stage of longan FEC development.It explained that the polyamine has not only the function like peroxidase for scavenging active oxygen,but enhance the activities of antioxidant enzymes.

Key words:longan;friable embryogenic callus;proteome;mass spectrometry

中图分类号:Q789

文献标志码:A

作者简介:李然(1984-),女,硕士,主要从事植物分子生物学研究。*通信作者:赖钟雄,博士,研究员,主要从事园艺植物生物技术与遗传资源研究。E-mail:laizx01@163.com

基金项目:国家自然科学基金(31272149,31071787,31201614);福建省重大科技平台建设(2008N2001)

收稿日期:2014-07-29;修改稿收到日期:2014-11-14

文章编号:1000-4025(2015)01-0107-11

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2015.01.0107