曹丹琴,杨　健,关晓弯,张永娟,龚凌燕,张水明

(安徽农业大学 园艺学院,合肥 230036)



石榴种皮木质素合成相关转录因子基因PgMYB的克隆与表达

曹丹琴,杨健,关晓弯,张永娟,龚凌燕,张水明*

(安徽农业大学 园艺学院,合肥 230036)

摘要:为初步探讨石榴(PunicagranatumL.)籽粒硬度产生机理及转录因子基因PgMYB在石榴种皮木质素生物合成途径中的作用,测定了不同石榴品种籽粒硬度及种皮总木质素含量并分析两者关系,利用RT-PCR结合RACE技术,克隆了‘红玉石籽’石榴的1个MYB转录因子基因(PgMYB),通过实时荧光定量PCR技术分析了PgMYB的相对表达量。结果表明:(1)石榴籽粒硬度与种皮总木质素含量呈显著正相关关系,相关系数为0.906。(2)PgMYB基因cDNA全长1 088 bp,开放阅读框921 bp,编码蛋白由306个氨基酸组成,N端具有2个MYB DNA结合结构域,是植物中一个典型的R2R3-MYB转录因子;同源分析显示,该基因编码的氨基酸序列与银合欢的MYB1和拟南芥的MYB4一致性分别高达89%和84%。(3)在不同籽粒硬度石榴品种中PgMYB的表达与籽粒硬度和种皮总木质素含量呈负相关关系。(4)在石榴各个发育时期中,PgMYB表达与种皮总木质素含量同样呈负相关关系。推测该基因可能抑制石榴种皮总木质素的生物合成。

关键词:石榴;籽粒硬度;种皮;总木质素;PgMYB基因;表达分析

石榴(PunicagranatumL.)为石榴科石榴属多年生落叶果树,主要分布在陕西、安徽、山东、四川、新疆、云南等地[1]。石榴果实中含有丰富的天然活性物质,具有较高的保健价值[2]。石榴中的软籽品种核软可食,无需吐籽,因而更受消费者喜爱,但有关软籽性状形成机理的研究甚少。山东农业大学在枣庄的调查发现石榴树随着更新次数的增加,果实种子有退化变软现象[3]。陆丽娟等[4]研究中国代表性石榴品种硬度时指出石榴种子硬度性状可能受多基因控制,且可能存在主效基因,同时发现光照、树体营养等环境因素对种子硬度也具有一定影响。

石榴籽粒包含假种皮、种皮和种仁等3个部分,通常可食用部分为假种皮,种仁中富含多种脂肪酸和蛋白质,具有较高的营养价值[5],而种皮中木质素含量较高[6]。木质素是植物体内的一种芳香性高聚物,主要沉积在维管植物次生增厚的细胞壁中[7]。木质素的生物合成主要受两类基因控制,一类是结构基因,另一类是调节基因。研究发现,MYB转录因子广泛参与植物苯丙烷类次生代谢途径的调节,该过程与木质素的合成调控密切相关[8-9]。根据高度保守的DNA结合结构域R的数目,可以把MYB转录因子分为单一MYB结构域蛋白(R3-MYB)、2个重复MYB结构域蛋白(R2R3-MYB)和3个重复MYB结构域蛋白(R1R2R3-MYB)[10]。其中R2R3-MYB可能是最直接调控木质素生物合成与沉积的转录因子,它们能调控参与苯丙烷类物质合成相关基因的表达,从而影响木质素的含量[11]。如火炬松(Pinustaeda)的PtMYB1、PtMYB4和PtMYB8[12-13],拟南芥的AtMYB58、AtMYB63[14]促进木质素的生物合成。玉米(Zeamays)的ZmMYB31和ZmMYB42[15],拟南芥的AtMYB4[16],杂交杨(PopulustremulaL.×tremuloidesMichx.)的PttMYB21a[17],银合欢(Leucaenaleucocephala)的LlMYB1[18],金鱼草(AntirrhinummajusL.)的AmMYB308和AmMYB330[19]则抑制木质素的生物合成。在石榴中尚未见到关于木质素生物合成相关MYB转录因子的研究报道。

本研究通过测定不同石榴品种的籽粒硬度与种皮总木质素含量,分析两者相关性,同时从参与木质素合成代谢的转录调控手段入手,应用RACE技术克隆PgMYB基因cDNA全长,Real time-PCR技术分析PgMYB在石榴不同品种和不同发育时期种皮中的表达特性,为深入研究石榴软籽性状形成机理打下了基础。

1材料和方法

1.1试验材料

材料采自安徽农业大学农业园石榴资源圃,土肥水管理水平一致。于2013年9月15日分别采集5年树龄的‘突尼斯软籽’、‘会理软籽’和‘红玉石籽’3个不同硬度品种成熟度一致的果实若干,剥取石榴籽粒,部分4 ℃保存,用于籽粒硬度和总木质素含量测定;部分-80 ℃保存,用于基因克隆与表达。

2013年5月20日始,在花后20、40、60、80、100和120 d,分别从‘红玉石籽’树冠外围东、西、南、北面及内膛枝条上摘取同期坐果、大小一致果实各2个,剥取石榴籽粒,部分4 ℃保存,用于总木质素含量测定;部分-80 ℃保存,用于基因表达分析。

1.2不同品种石榴籽粒硬度测定

随机选取‘突尼斯软籽’、‘会理软籽’和‘红玉石籽’3个品种的石榴籽粒各20个,去除外层假种皮,擦净待用。选用Texture Analyser质构仪P/36R圆柱型平底探头,在质构剖面分析(Texture Profile Analysis,TPA)测试模式下,设定0.5 mm的目标压缩形变量(进入样品的运行距离),探头对样品进行两次压缩循环,测得所需的硬度质构指标,单位为g·cm-2。

1.3总木质素含量测定

采用巯基乙酸法[20]分别对‘突尼斯软籽’、‘会理软籽’、‘红玉石籽’3个石榴品种和花后20、40、60、80、100和120 d的‘红玉石籽’石榴种皮的总木质素含量进行测定,各样品测定均3次重复取平均值。

1.4PgMYB基因cDNA全长克隆及生物信息学分析

1.4.1石榴MYB基因中间片段的获得根据GenBank上已经登录的几种植物MYB基因的DNA结合结构域保守区设计目的片段扩增引物MYB-F和MYB-R(表1),参照改良的CTAB法[21]提纯‘红玉石籽’石榴种皮的总RNA,以其为模板进行RT-PCR,PCR反应条件为:94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,35个循环;72 ℃ 延伸10 min,PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。将PCR产物进行回收并连接至pGEM-Teasy载体(Promega公司)上,转化大肠杆菌DH5α(上海康润生物公司)进行克隆,挑取单菌落进行菌液PCR检测,将阳性菌落送至上海生工生物公司进行测序。

1.4.2cDNA末端扩增根据获得的MYB中间片段核苷酸序列,设计用于3′端和5′端克隆的基因特异引物(表1)。以3′-CDS为接头(表1),反转录得到3′-RACE cDNA,分别用3′GSP1、3′GSP2和3′通用引物UPM-Long和NUP进行3′端扩增,具体操作流程参照SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit User Manual试剂盒(Clontech公司)说明书进行。用5′MYB-F1和5′MYB-R1进行5′端序列克隆,回收扩增产物并连接至pGEM-Teasy载体,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆测序鉴定。

1.4.3PgMYB全长cDNA拼接及生物信息学分析将获得的MYB中间片段和cDNA末端序列进行拼接,获得PgMYB基因的cDNA全长序列。将PgMYB序列在NCBI数据库中用BLAST工具进行同源分析;利用ORF(Open Reading Frame,ORF)finder软件寻找开放阅读框;Protparam软件(http://web.expasy.org/protparam/)分析编码蛋白的氨基酸序列组成、分子量、等电点等理化性质;Psort(http://psort.hgc.jp/form.html)进行亚细胞定位分析;BioXM 2.6软件进行蛋白质一致性和相似性分析;用MEGA5软件构建系统进化树。

1.5PgMYB表达分析

1.5.1PgMYB在不同品种石榴种皮的表达分析运用RT-PCR检测PgMYB基因在‘突尼斯软籽’、‘会理软籽’和‘红玉石籽’3个品种石榴种皮中的表达情况,以石榴Actin为内参,设计特异引物PgActin-F/PgActin-R及PgMYB-F/PgMYB-R(表1),在Step One PlusTM荧光定量PCR仪上进行扩增。采用20 μL反应体系:SYBRTMPremixExTaq10 μL,10 μmol·L-1的上下游引物各0.8 μL,ROX Reference Dye 50X 0.4 μL,cDNA模板2.0 μL,ddH2O 6.0 μL。反应程序为:95 ℃预变性30 s;95 ℃变性5 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸 1 min,共40个循环。每个样品4次重复。反应完成后,用2-△△Ct法进行相对表达量分析。

1.5.2PgMYB在不同发育时期石榴种皮的表达分析以花后20、40、60、80、100和120 d的‘红玉石籽’种皮cDNA为模板,以石榴Actin为内参,对PgMYB基因表达量进行荧光定量检测,具体方法同1.5.1。

2结果与分析

2.1石榴不同品种籽粒硬度和种皮总木质素含量

3个石榴品种中,‘突尼斯软籽’籽粒硬度最小,种皮总木质素含量最低,分别为1 997 g·cm-2和6.36%;其次是‘会理软籽’,籽粒硬度为3 811 g·cm-2,种皮总木质素含量为7.57%;籽粒硬度和种皮总木质素含量均最大的为‘红玉石籽’,分别为4 235 g·cm-2和9.25%(图1)。SPSS分析发现,石榴籽粒硬度与种皮总木质素含量呈显著正相关,相关系数为0.906。

表1　PCR扩增所用引物及其序列

2.2石榴PgMYB基因的克隆

RT-PCR扩增MYB基因cDNA同源片段,挑选阳性克隆测序得到一个长291 bp的核酸片段(图2,A),序列比对结果显示,该片段序列与水稻(Oryzasativa)的OsMYB2和玉米的ZmMYB31序列一致性分别高达87%和86%,初步判断该片段为石榴MYB基因序列片段。

3′端扩增得到一个819 bp的带有多聚A尾巴的片段(图2,B),登陆NCBI进行核酸序列比对,表明该片段序列与玉米的ZmMYB31和柳枝稷(Panicumvirgatum)的PvMYB4a序列一致性高达85%,且3′端序列与原同源片段部分重叠,确认其为石榴MYB基因的3′端序列。5′端扩增得到一个长436 bp的片段(图2,C),序列比对分析确定为石榴MYB基因的5′端序列。

2.3PgMYB全长cDNA拼接及生物信息学分析

将获得的两端序列与同源片段序列进行拼接得到一个长1 088 bp的cDNA序列。序列分析表明,PgMYB基因编码区由921个核苷酸组成,编码一个含有306个氨基酸的蛋白质,起始密码子为ATG,终止密码子为TGA(图3)。NCBI在线比对发现,该基因编码的氨基酸序列与银合欢、杨树(Populus)、拟南芥等植物中MYB转录因子基因编码的氨基酸序列一致性都达到84%以上。Protparam分析其理化性质,推测该蛋白的分子式C1468H2332N454O461S17,相对分子量为34 262.4,等电点(pI)为8.85。InterPro数据库鉴定结果显示,Pg-MYB具有两个典型的MYB-DNA-binding结构域(图4),为典型的R2R3-MYB转录因子基因。亚细胞定位研究表明,PgMYB蛋白定位于细胞核(可能性91.3%),符合转录因子的亚细胞定位特征。将PgMYB推导的氨基酸序列与其他植物中调控木质素合成代谢的R2R3-MYB转录因子氨基酸序列进行比对,并构建系统进化树(图5),发现PgMYB与桉树(Eucalyptusgunnii)的EgMYB1(GenBank登录号:AJ576024.1)和拟南芥AtMYB32(GenBank登录号:NM_119665.2)进化关系相对较近。GenBank中做同源性分析表明PgMYB基因氨基酸序列与其他MYB转录调控因子的同源区域主要集中在N端R2R3 DNA结合结构域,在C端同源性极低。

2.4不同品种石榴种皮PgMYB的表达和总木质素含量分析

在籽粒硬度最小的‘突尼斯软籽’中PgMYB相对表达量最大,以‘突尼斯软籽’为1,‘会理软籽’中PgMYB表达量为‘突尼斯软籽’的0.38,籽粒硬度最大的‘红玉石籽’中PgMYB表达量最低,仅为‘突尼斯软籽’的0.23。籽粒硬度越小的品种,Pg-MYB表达量越高,同时种皮总木质素含量就越低,相关分析结果显示,PgMYB的表达与籽粒硬度和种皮总木质素含量呈负相关(图6)。

图1　石榴不同品种籽粒硬度和种皮总木质素含量

图3　PgMYB基因的核苷酸序列和推测的氨基酸序列

图2　PgMYB基因同源片段(A)、3′-RACE(B)和5′-RACE(C)扩增结果

图4　不同植物MYB氨基酸序列比对

图5　木质素合成相关R2R3-MYB转录因子进化树

2.5不同发育时期石榴种皮PgMYB的表达和总木质素含量分析

RT-PCR分析PgMYB在‘红玉石籽’不同发育时期种皮中的表达特性(图7)发现:在花后20 d,PgMYB表达量最高,且随着果实发育,PgMYB的表达量逐渐下降。巯基乙酸法测定‘红玉石籽’不同发育时期种皮的总木质素含量(图7),结果显示:盛花后20、40、60、80、100和120 d,木质素含量持续上升,在果实发育前期,木质素含量积累较快,后期木质素含量上升趋势平缓。PgMYB表达与总木质素含量呈负相关。

图6　不同品种石榴种皮PgMYB的

图7　不同发育时期石榴种皮PgMYB的

3讨论

石榴果实营养丰富,其籽粒中含有丰富的维生素、烟酸、植物雌激素以及抗氧化物质鞣酸等,具有多种医疗保健作用[22]。石榴籽粒有软籽和硬籽之分,市场上较多的是鲜食硬籽品种,营养可利用价值少,而软籽石榴核软可食,营养充分利用,探讨石榴软籽性状形成机理具有重要意义。本研究通过测定‘突尼斯软籽’、‘会理软籽’和‘红玉石籽’的籽粒硬度和种皮总木质素含量并分析两者关系,发现石榴籽粒硬度与种皮中总木质素含量呈显著正相关,种皮中的总木质素是构成籽粒硬度的一个重要组分,这为深入了解石榴软籽性状形成原因提供基础。

木质素生物合成主要受结构基因和调节基因两类基因控制,由调节基因编码的转录因子可以调控结构基因的表达。MYB是植物中最重要的转录因子之一,在不同物种中,MYB蛋白结构和序列存在差异,甚至同一物种的MYB家族也存在多个分支[23],MYB高度保守的DNA结合结构域为分离和鉴别MYB家族成员提供了理论基础[24]。本研究根据与木质素合成相关的MYB基因保守区域序列设计简并引物,结合RACE技术从石榴中分离得到PgMYB基因,其推导的氨基酸N端具有2个保守的DNA结合结构域,亚细胞定位显示其定位于细胞核,符合转录因子亚细胞定位的特征。分析PgMYB蛋白与其他MYB蛋白的进化关系发现其与桉树的EgMYB1[25]和拟南芥的AtMYB32[26]进化关系相对较近,而这两者被鉴定为在木质素生物合成中起转录抑制作用,推测PgMYB是一个R2R3亚类转录因子基因,可能在石榴种皮木质素生物合成过程中起抑制作用。

本研究通过荧光定量PCR技术分析发现PgMYB在3个不同硬度石榴品种中的表达存在差异,籽粒硬度越小的品种,表达量越高,同时种皮总木质素含量越低。对花后20、40、60、80、100和120 d的‘红玉石籽’石榴种皮总木质素含量进行测定,发现在其不同发育时期中,木质素含量持续上升,而PgMYB的表达水平随着发育期的进行逐渐下降,与总木质素含量呈负相关,推测PgMYB可能抑制石榴种皮木质素的生物合成,这为深入了解和调控石榴软籽性状奠定了基础。木质素是影响石榴籽粒硬度的一个重要因子,由于木质素生物合成途径复杂,MYB蛋白作为植物中一类重要的转录因子,其调控石榴种皮木质素的生物合成途径及其具体的作用机理还有待于进一步研究探讨。

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(编辑:宋亚珍)

Clone and Expression of a Lignin Biosynthesis-related Transcription

Factor GenePgMYBin Pomegranate Seed Coat

CAO Danqin,YANG Jian,GUAN Xiaowan,ZHANG Yongjuan,GONG Lingyan,ZHANG Shuiming*

(College of Horticulture,Anhui Agricultural University,Hefei 230036,China)

Abstract:To study the mechanism of pomegranate seed hardness,and the function of transcription factor genePgMYBin lignin biosynthesis pathway of pomegranate seed coat,we measured the seed hardness and total lignin content in different pomegranate cultivars.A novelMYBtranscription factor genePgMYBwas isolated from cultivar ‘Hongyushizi’ by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and rapid amplification of cDNA ends (RACE).The expression levels ofPgMYBwere analyzed by real time-PCR.The results showed that:(1)The hardness of pomegranate seed and the total lignin content in seed coat were positively correlated with a correlation coefficient of 0.906.(2)The full-length cDNA ofPgMYBwas 1 088 bp with an open reading frame of 921 bp encoding a protein of 306 amino acid residues.It’s a typical R2R3-MYB transcription factor gene in plant with twoMYBDNA binding domains at its N-terminus.Blast X analysis showed thatPgMYBhad high identity withLeucaenaleucocephalaMYB1 andArabidopsisthalianaMYB4 as 89% and 84%,respectively.(3)Real time-PCR analysis indicated that the relative expression ofPgMYBwas negatively correlated with the hardness of pomegranate seed and total lignin content in seed coat.(4)At each stage of ‘Hongyushizi’ fruit development,the relative expression ofPgMYBwas always negatively correlated with the total lignin content in seed coat.It was speculated thatPgMYBmight repress the biosynthesis of lignin in pomegranate seed coat.The results expected to lay a foundation for study the mechanism of pomegranate seed hardness.

Key words:pomegranate;seed hardness;seed coat;lignin;PgMYBgene;expression analysis

中图分类号:Q785;Q786

文献标志码:A

作者简介:曹丹琴(1990-),女,在读硕士研究生,主要研究果树种质资源与生物技术育种。E-mail:15956998735@163.com*通信作者:张水明,博士,副教授,主要从事园艺植物种质资源与生物技术育种研究。E-mail:zhangshm893@sohu.com

基金项目:国家自然科学基金(30900971)

收稿日期:2014-09-17;修改稿收到日期:2014-12-02

文章编号:1000-4025(2015)01-0023-07

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2015.01.0023