翟艺宗，黄昌林，常祺，王久清，张佳，郭延岭

运动性疲劳是指因机体的生理过程不能维持在特定水平或机体不能维持预定的运动强度而导致运动能力下降的现象[1]。肝脏作为人体最大的腺体，在物质代谢、维持机体血糖恒定及供能方面有着重要作用。线粒体是真核细胞功能活动的主要供能单位[2]，可通过其内膜呼吸链的氧化磷酸化反应为机体生成80%以上的ATP[3]，在维持肝脏细胞正常的能量代谢和功能方面具有重要作用。线粒体是适应运动方式最为敏感的细胞器之一[4]，Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶位于线粒体内膜中[5]，能维持线粒体膜电化学梯度[6]，是线粒体功能、结构变化的灵敏指标。本研究采用游泳力竭大鼠模型，应用分子生化技术探讨脉冲电流经皮刺激肝区对运动性疲劳大鼠肝脏线粒体Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影响，以进一步探讨脉冲电流经皮刺激肝区缓解疲劳的相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选择健康8周龄雄性W istar大鼠72只，体重204±15g，由河南省实验动物中心提供，饲养室温度23±2℃，湿度41%±15%，自然光照，分笼饲养，自由摄食及饮水。实验前适应性喂养1周。所有动物实验前均未进行过游泳运动。

1.2 主要试剂及仪器 线粒体超微量Na+-K+-ATP酶及Ca2+-M g2+-ATP酶测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京索莱宝生物技术有限公司)；盐酸氯胺酮注射液(国药准字H35020148，福建古田药业有限公司)；LD5-2A离心机(北京雷勃尔离心机有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物模型建立及分组 将实验动物随机分为安静对照组(A组)、疲劳对照组(B组)、疲劳前刺激组(C组)、疲劳后刺激组(D组)，每组18只。按组别分笼饲养。实验开始前3d，每只大鼠每天学习游泳30m in，水温32±1℃，水深70cm，随后连续进行5周实验。B、C、D组大鼠每周进行游泳训练6d，休息1d，每日游泳2次，每次均达到力竭，当

大鼠浮在水面不运动时用木棒驱赶，维持其运动状态。力竭标准以大鼠下沉后10s不露出水面为准，记录每只大鼠的游泳力竭时间。每组大鼠游泳后换水。B、D组大鼠在游泳后，C组大鼠在游泳前分别给予腹腔注射盐酸氯胺酮注射液0.25g/kg麻醉。C组大鼠在游泳前、D组大鼠在游泳力竭后分别以频率为1024Hz的脉冲电流刺激肝区，电流强度均为10m A，间动周期为1s，时间均为20m in，2次/d。1.3.2 取材、标本制备及指标检测 各组大鼠分别在1、3、5周末分批断头处死，每组各时间点6只，处死前动物禁食水过夜。大鼠处死后立即剖腹取肝脏组织1g，用液氮迅速冷冻保存备用。肝脏标本溶化后仍保持2～8℃的温度，眼科剪剪碎后，加入9m l PBS液(pH 7.4)，用超声匀浆器将标本充分匀浆，3000r/m in离心20m in，收集上清液，分装后待检测，整个操作过程均在0～4℃下进行。采用分光光度法[7]测定1、3、5周各组动物的肝脏线粒体Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性，应用UV-2450紫外/可见分光光度计检测其吸光度(A)值，波长636nm，其结果用μkat/g表示。采用Brad food蛋白定量法测定[8]进行大鼠肝脏线粒体蛋白定量。

1.4 统计学处理 采用SPSS 18.0软件进行统计分析，计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 运动性疲劳大鼠游泳力竭时间的比较 第1周末3组大鼠游泳力竭时间差异无统计学意义(P＞0.05)。第3、5周末D组大鼠游泳力竭时间均明显长于B组和C组(P＜0.05)，而B组与C组比较差异无统计学意义(P＞0.05，表1)。

2.2 各组大鼠肝脏线粒体Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的比较 第1周末4组大鼠肝脏线粒体Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性比较差异无统计学意义(P＞0.05)。第3、5周末B组大鼠肝脏线粒体Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性明显低于其余3组，且C组大鼠肝脏线粒体Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性明显低于D组，差异均有统计学意义(P＜0.05，表2)。

表1 运动性疲劳大鼠游泳力竭时间(m in，±s，n=6)Tab. 1 The exhaustive sw imm ing tim e of exercise-induced fatigued rats (m in, ±s, n=6)

表1 运动性疲劳大鼠游泳力竭时间(m in，±s，n=6)Tab. 1 The exhaustive sw imm ing tim e of exercise-induced fatigued rats (m in, ±s, n=6)

(1)P＜0.05 com pared with group B; (2)P＜0.05 com pared with g roup C

Group Training tim e (w eek)1 3 5 B 94.59±8.51 101.72±7.23 111.59±8.42 C 93.80±10.89 105.46±9.89 119.18±10.27 D 97.26±11.62 115.35±12.19(1)(2)132.39±9.44(1)(2)

表2 各组大鼠肝脏线粒体Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性比较(μkat/g，±s，n=6)Tab. 2 Com parison of the hepatic m itochond rial Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase activity in the rats (μkat/g, ±s,n=6)

表2 各组大鼠肝脏线粒体Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性比较(μkat/g，±s，n=6)Tab. 2 Com parison of the hepatic m itochond rial Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase activity in the rats (μkat/g, ±s,n=6)

(1)P＜0.05 com pared with g roup A; (2)P＜0.05 com pared with g roup B; (3)P＜0.05 com pared with g roup C

Group Na+-K+-ATPase Ca2+-Mg2+-ATPase 1st w eek A 1.179±0.263 1.143±0.187 B 1.128±0.226 1.127±0.156 C 1.181±0.237 1.133±0.162 D 1.284±0.271 1.184±0.171 3rd w eek A 1.165±0.233 1.137±0.151 B 1.015±0.241(1) 1.017±0.161(1)C 1.251±0.219(2) 1.242±0.158(2)D 1.528±0.242(2)(3) 1.487±0.155(2)(3)5 th w eek A 1.183±0.257 0.148±0.164 B 0.915±0.227(1) 0.875±0.153(1)C 1.308±0.224(2) 1.327±0.160(2)D 1.631±0.257(2)(3) 1.592±0.151(2)(3)

3 讨 论

线粒体是细胞有氧代谢的重要场所[9]，氧化磷酸化是机体内重要的能量来源，由线粒体内膜的呼吸链完成。线粒体氧化磷酸化的关键是线粒体内膜功能及通透屏障的完整性[10-11]。Ca2+在调控线粒体功能及ATP合成过程中起着重要作用[12]，刺激氧化磷酸化是其最基本的功能之一。根据M ithell提出的化学渗透假说，呼吸链位于线粒体内膜的外侧，当H+在膜外侧堆积时，会导致膜内外的跨膜电位差，这是线粒体氧化磷酸化过程中发生的根本态势。此种化学电位差被膜上的ATP酶有效利用，可以从Pi+ADP合成ATP。同时，化学电位差导致了线粒体Ca2+内流，随着Ca2+内流增加，线粒体内膜阳离子净增加，导致内膜去极化，为了保持内膜的去极化状态，线粒体通过生物氧化以加快H+外排。Ca2+内流可破坏线粒体生物氧化的过程，使机体合成ATP的能力下降。

目前有研究发现，有氧运动可以提高线粒体Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性[4]。力竭运动可导致大鼠肝脏自由基产生增多，脂质过氧化严重，肝脏MDA含量增加，酶的活性降低[13]。本研究结果表明，脉冲电流经皮刺激运动性疲劳大鼠肝区可以提高肝脏线粒体Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性，而线粒体Na+-K+-ATP酶的活性增高可减少线粒体水钠潴留，减轻线粒体肿胀，此外，Na+-K+-ATP酶除了可维持跨膜的电化学钠、钾离子梯度以外，还可降低线粒体内游离钙浓度，减轻线粒体钙超载[14]。

本课题组前期研究表明，脉冲电流经皮刺激运动性疲劳大鼠肝区能够降低肝组织Bax的表达，提高Bc l-2的表达，维护肝组织的正常结构[13]。采用频率为1024Hz的脉冲电流刺激(电流强度10m A，间动周期1s)可加速乳酸代谢，提高运动耐力，减轻运动性疲劳导致的肝损伤[15-17]。本研究结果显示，第3周末、第5周末D组大鼠游泳力竭时间均明显长于B组和C组(P＜0.05)，而B组与C组比较差异无统计学意义(P＞0.05)，表明脉冲电流经皮刺激运动性疲劳大鼠肝区可以提高其运动耐力及运动成绩。A组、C组及D组大鼠肝脏线粒体Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性在第3、5周末均高于B组，差异有统计学意义(P＜0.05)，表明脉冲电流经皮刺激运动性疲劳大鼠肝区可以提高其活性水平，增强线粒体氧化磷酸化，降低线粒体内游离钙浓度，从而缓解运动性疲劳。

综上所述，运动性疲劳可以降低肝脏线粒体Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性，脉冲电流经皮刺激运动性疲劳大鼠肝区可以提高其活性水平，降低线粒体内游离钙浓度，并减少线粒体钙超载，刺激氧化磷酸化，提高运动耐力及运动成绩，加速机体运动性疲劳的消除。此外，运动性疲劳的发生及消除是一个非常复杂的过程，尽管目前的研究已经取得了较大进展，但对于肝脏线粒体与运动性疲劳之间的确切关系还需要进一步深入探讨。

[1] Feng WQ, Xie MH. Exercise biochem istry research[M]. Beijing:Beijing Sport University Pub lishing House, 2007. [冯炜权, 谢敏豪. 运动生物化学研究进展[M]. 北京: 北京体育大学出版社, 2007.]

[2] Sun F, Zhou QJ, Sun J. Structure of m itochond rial respiratory m em brane p rotein com p lex[J]. Chin Bu ll Life Sci, 2008, 20(4):567-572. [孙飞, 周强军, 孙吉. 线粒体呼吸链膜蛋白复合体的结构[J]. 生命科学, 2008, 20(4): 567-572.]

[3] Papa S. Mitochond rial oxidative phosphorylation changes in the lifespan: Mo lecu lar aspects and physiological im p lications[J].Bioch im Biophys Acta, 1996, 1276(2): 87-105.

[4] Cao Y, Zhang M, Dong JL, et al. The influence of aerobic exercise to the rat skeletal m uscle's Na+-K+-ATP enzym e, Ca2+-Mg2+-ATP enzym e and the m itochond rial sw elling[J]. Chin J Tissue Eng Res, 2010, 14(37): 6973-6975. [曹颖, 张敏, 董嘉良, 等. 有氧运动对大鼠骨骼肌线粒体Na+，K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶及线粒体肿胀的影响[J]. 中国组织工程研究及临床康复,2010, 14(37): 6973-6975.]

[5] De Meis L, Arruda AP, da Costa RM. Iden tification of a Ca2+-ATPase in b row n ad ipose tissue m itochond ria: regu lation of therm o genesis by ATP and Ca2+[J]. J Bio l Chem, 2006,281(24): 16384-16390.

[6] Venkatram an M, Konga D, Peram aiyan R, et al. Reduction of m itochond rial oxidative dam age and im p roved m itochond rial efficiency by adm inistration of crocetin against bebzo[a]p ryene induced experim ental anim als[J]. Biol Pham Bu ll, 2008, 31(9):1639-1645.

[7] Vyatkina G, Bhatia V, Gerstner A, et al. Im paired m itochond rial resp irato ry chain and b ioenergetics du ring chagasic cardiom yopathy developm ent[J]. Biochim Biophys Acta, 2004,1689(2): 162-173.

[8] Brad ford MM. A rapid and sensitive m ethod for the quab tition of m icrogram quantities of p rotein utilizing the p rincip le of p ro teindye bind ing[J]. Anal Biochem, 1976, 72: 248-254.

[9] Ji YB, Li R, Ji CF. Sports fatigue and m itochond rial function[J].Asia Pac Trad it Med, 2008, 4(9): 8-11. [季宇彬, 李睿, 汲晨锋.运动性疲劳与线粒体功能[J]. 亚太传统医药, 2008, 4(9):8-11.]

[10] Chang B. Effect of exe rcise-induced free rad ica ls on m itochond rion free calcium and ATP synthesis activity in rats'kidney[J]. J Shanghai Univ Sport, 2006, 30(2): 74-76. [常波. 运动源性自由基对大鼠肾脏线粒体游离钙和ATP合成能力的影响[J]. 上海体育学院学报, 2006, 30(2): 74-76.]

[11] Dai PY, Huang CL. In fluence of percu taneous stim u lation of hepatic region with m id-frequency pu lse cu rren t on the activity of serum GSH-PX, SOD, T-AOC and the con ten t of m alondialdehyde in exercise-induced fatigued so ldiers[J]. Med J Chin PLA, 2014, 39(3): 245-248. [代朋乙, 黄昌林. 中频脉冲电流经皮刺激运动性疲劳士兵肝区对血清GSH-PX、SOD、T-AOC活性及MDA含量的影响[J]. 解放军医学杂志,2014, 39(3): 245-248.]

[12] Feissner RF, Skalska J, Gaum WE, et al. Crosstalk signaling betw een m itochond rail Ca2+and ROS[J]. Fron t Biosci(Landm ark Ed), 2009, 14: 1197-1218.

[13] Huang CL, Zhu LG. An ti-fatigue effect of percu taneous stim u lation with different frequency pu lse current on hepatic region: an experim en tal study with rats[J]. Med J Chin PLA,2009, 34(6): 743-745. [黄昌林, 朱履刚. 脉冲电流经皮刺激运动疲劳大鼠肝区对肝细胞Bcl-2、Bax表达及超微结构的影响[J].解放军医学杂志, 2009, 34(6): 743-745.]

[14] Mo teg i K, Tanonaka, K, Tanaga Y, et al. Preservation of m itochond rial function m ay contribute to card iop rotective e ffects of Na+/Ca2+exchanger inh ib ito rs in ischaem ic/reperfused rat hearts[J]. Br J Pharm acol, 2007, 151(7): 963-978.

[15] Dai PY, Huang CL. Im pact of m id-frequency pu lse cu rren t in different dia dynam ic cycles to hepatic region on restorability of exercise-induced fatigue in so ldiers[J]. Med J Chin PLA, 2012,37(1): 66-69. [代朋乙, 黄昌林. 不同间动周期中频脉冲电流经皮刺激肝区对运动性疲劳士兵的抗疲劳作用观察[J]. 解放军医学杂志, 2012, 37(1): 66-69.]

[16] Dai PY, Huang CL. Im pact of m id-frequency pu lse cu rren t in different diadynam ic cycles to hepatic region on restorability of exercise-induced fatigue in so ldiers[J]. Med J Chin PLA, 2012,37(1): 66-69. [代朋乙, 黄昌林. 不同间动周期中频脉冲电流经皮刺激肝区对运动性疲劳士兵的抗疲劳作用观察[J]. 解放军医学杂志, 2012, 37(1): 66-69.]

[17] Sun QJ, Liang B, M iao MY, et al. Card iop rotective effects of atorvastatin postconditioning on ischem ia-reperfusion in jury in isolated rat heart: the ro le of PI3K-Akt, m ito-KATP channel and m PTP[J]. Med J Chin PLA, 2010, 35(11): 1341-1344. [孙青菊,梁冰, 缪明永, 等. 肝再生早期线粒体差异表达蛋白质组分析[J]. 解放军医学杂志, 2010, 35(11): 1341-1344.]