梁振纲，徐志伟，陈艺玮，邓世明，徐　莉

(1.海南大学海洋学院,海南海口570228；2.海南出入境检验检疫局技术中心，海南海口570311)



高效液相色谱-串联质谱法测定水产品中3种微囊藻毒素含量

梁振纲1,2，徐志伟2，陈艺玮2，邓世明1*，徐莉2

(1.海南大学海洋学院,海南海口570228；2.海南出入境检验检疫局技术中心，海南海口570311)

摘要：建立高效液相色谱-串联质谱法测定水产品中 microcystin-LR、microcystin-RR、microcystin-YR 3种微囊藻毒素含量的方法，对方法的提取、净化条件和微囊藻毒素可能的质谱裂解机理进行研究。采用甲醇提取，HLB固相萃取柱净化，液相色谱-质谱/质谱进行检测，外标法定量，测定低限为5 μg/kg，以鱼、虾、牡蛎为阴性样品，添加水平为0.005 mg/kg、0.010 mg/kg、0.020 mg/kg时，回收率范围为85.2%～94.3%，相对标准偏差为4.7%～8.1%。经验证，此方法灵敏度、特异性和选择性均能满足水产品中微囊藻毒素的检测要求。

关键词：微囊藻毒素；高效液相色谱-串联质谱；水产品

近年来，随着富营养化程度的加剧，蓝藻释放的毒素已经成为一类广泛存在的天然有毒物。其中微囊藻毒素(microcystins)是一类单环七肽结构的天然毒素，它分布广，毒性强，可致家畜死亡和人类中毒[1]。由于它能抑制蛋白质磷酸酯酶，从而帮助解除对细胞增殖的正常制动作用，促进肿瘤的发育，是肝癌的强烈促癌剂。目前世界上已发现50多种微囊藻毒素，其中microcystin-LR、microcystin-RR和microcystin-YR毒性较大，含量也相对较多[2]，因此建立这3种微囊藻毒素的检测方法非常重要。

由于微囊藻毒素类化合物分子量较大，极性强，在样品中含量低，有一定的检测难度。目前文献报道多采用高效液相色谱-紫外检测器[3-4]和酶联免疫法[5-6]等方法检测水或藻类中微囊藻毒素，由于水产品富含蛋白质和脂肪类物质，基质干扰大，因此鲜少文献报道水产品基质中微囊藻毒素的检测。HPLC-紫外检测器虽可对多肽进行有效分离，但是在灵敏度和选择性方面存在一定问题；酶联免疫法则存在难于定性、定量不准等问题。而电喷雾(ESI)质谱作为一种可同时定性定量的技术，非常适合微囊藻毒素类大分子物质的检测，且灵敏度和选择性好，因此本文采用高效液相色谱-串联质谱法建立了水产品中微囊藻毒素的检测方法，方法快速简便，定量准确，并可在线定性，具有较强的适用性[7-8]。

1材料与方法

1.1仪器与试剂

Agilent 1200超高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)，API 4000Q四极杆质谱仪(美国ABI公司)，配有电喷雾离子源；Harvard Ⅱ针泵(美国Varian公司)；MS3 Basic旋涡混匀器(广州IKA公司)；Centrifuge 5810R离心机(Eppendorf公司)；G-285电子天平(Mettler公司)，氮吹仪(美国Caliper公司)。

乙腈、甲醇、甲酸为色谱纯试剂(美国TEDIA公司)，HLB固相萃取小柱(3 mL，60 mg，美国Waters公司)，微孔滤膜(0.22 μm，有机系)，微囊藻毒素-LR、微囊藻毒素-RR、微囊藻毒素-YR标准品(纯度均大于等于95%，购自德国Dr.Ehrenstorfer公司)。标准溶液：用甲醇配制成100 μg/mL标准储备液，-20 ℃避光保存。

地理国情普查是基于遥感影像采用计算机自动解译或人工解译方法定量化获取地表自然及人文地理要素的国情国力调查，解译内容涉及房屋、水体、道路、构筑物、植被、裸露地表等多种要素。因此，解译中遥感影像的信息使用量对地理国情普查至关重要。

近年来，阳江航标管理站的灯浮标受热带气候影响时有发生，当灯浮标附近风力达11级左右时，灯浮标就存在着移位的情况。如2014年“威马逊”台风7月18日在海南文昌登陆，阳西电厂附近当时风力12级左右，有部分灯浮标移位或直接吹上岸边；漭洲障碍物标移位1000多m。

1.2样品的提取

准确称取2 g粉碎均匀的样品(精确至0.01 g)，置于50 mL具塞聚丙烯离心管中，加入10 mL甲醇，3 000 r/min涡旋混匀2 min，4 ℃下以8 500 r/min离心5 min，上清液转移至玻璃试管中，40 ℃下氮气吹至约1 mL，加水9 mL，混匀，转移至另一50 mL具塞聚丙烯离心管中。原玻璃试管中再加入1 mL甲醇，9 mL水，混匀，转移至同一50 mL具塞聚丙烯离心管中，混合均匀后4 ℃下以8 500 r/min离心5 min，收集提取液。

1.3样品的净化

微囊藻毒素-LR、RR和YR为相似结构的环状七肽化合物，其中YR和LR易生成单电荷分子离子(M+H)+，RR由于含有2个精氨酸结构，易生成双电荷分子离子(M+2H)2+，分子极性较大，因此选用ESI电离模式。用注射泵将3种微囊藻毒素分别以10 μL/min的速度直接注入离子源，ESI正离子模式扫描。一级质谱分析(Q1扫描)显示，LR和YR形成了稳定的995.6和1 045.5(m/z)的(M+H)+准分子离子，RR形成了稳定的519.9(m/z)的(M+2H)2+双电荷离子峰。可能的质谱裂解机理如图2所示：

1.4色谱条件

微囊藻毒素分子离子的氢正离子转移至甲氧基上，形成氧正离子，然后发生α断裂，C-C键断开，形成m/z135的子离子。此离子可能发生分子内的氢转移重排，形成更稳定的共轭正离子。

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表1　流动相梯度洗脱条件

1.5质谱条件

船舶轴系校中技术分为静态校中和动态校中两种。静态校中技术又可分为直线校中、轴承上允许负荷校中和轴系合理校中三种方法。在船舶修理和建造过程中，轴系用直线校中时常采用三种方法，即用光学仪器校中法、按连接法兰上规定的偏中值校中法和用样轴校中法。

电喷雾离子源(ESI)；正离子扫描；多反应监测(MRM)模式；离子源温度550 ℃；离子源电压5 500 V；雾化气、气帘气、辅助气和碰撞气均为高纯氮气。质谱优化条件见表2。

表2　3种微囊藻毒素的质谱优化条件

*表示定量离子。*indicates the quantitative ions.

2结果与讨论

2.1提取溶剂的选择

新周期的奥运备战工作正如火如荼地进行，不管是东京奥运会还是北京冬奥会，都让无数的运动健儿们以最大努力准备迎接光辉时刻。筹办好北京冬奥会、冬残奥会是十九大报告中提出的要求，也是体育强国的重要体现。随后而来的也将是新一轮的退役风暴，在新举国体制的背景下，多方力量尚未形成完善的合作机制，这加大了退役安置保障工作的压力。退役运动员的价值该如何体现，依然是退役安置保障工作的相关职能部门面临的重要课题。

2.2净化条件的选择

水产品的净化一般采用C8、C18、MCX和HLB等固相萃取柱，方法考察了这4种萃取柱的净化效果，结果发现使用HLB固相萃取小柱净化时回收率最高，特异性好，能够有效去除杂质干扰。这可能是由于微囊藻毒素易溶于水和醇，分子结构中有大量的氨基[9-10]。洗脱溶液也是影响目标物回收率的重要因素之一。本实验考察了不同比例的甲醇-水溶液作为洗脱液时的回收率。结果发现，当洗脱溶液中甲醇含量低于40%时，3种微囊藻毒素回收率均较低；随着甲醇比例增大，回收率呈上升趋势；当甲醇含量不低于80%时，3种微囊藻毒素回收率稳定在85.2%～94.3%，因此本文选择80%甲醇作为洗脱溶液。

2.3色谱条件优化

1.微囊藻毒素RR；2.微囊藻毒素YR；3.微囊藻毒素LR1.microcystin-RR；2.microcystin-YR；3.microcystin-LR图1　3种微囊藻毒素混合标样优化前后的MRM色谱图(甲醇-水体系(左)和乙腈-水体系(右))Fig.1　The MRM chromatogram of 3 microcystins before(left:CH3OH-H2O System) andafter(right:CH3CN-H2O System) optimizing the mobile-phase

本方法考察了C8，C18，HSS C18，HSS T3色谱柱的分离效果，发现HSS T3色谱柱分离效果最好。同时比较了甲醇/水体系、乙腈/水体系、甲醇/0.1%甲酸、乙腈/0.1%甲酸、甲醇/0.1%乙酸铵、乙腈/0.1%乙酸铵体系作为流动相的分离效果，发现乙腈/水体系分离效果优于甲醇/水体系，而在水中添加甲酸有利于保持峰形和保留时间的稳定，且有助于提高ESI正离子的电离效率，因此本方法选择乙腈/0.1%甲酸为流动相(图1)。本方法研究了流动相的洗脱比例，结果发现，当乙腈的比例从开始的20%上升至60%即可将3种微囊藻毒素完全分离。为避免水产品基质中一些保留较强的物质滞留，本方法选择在待测物完全流出后1 min内将乙腈的比例由60%上升至95%，以便将基质中的强保留干扰物质全部洗脱。

由于水产品中含有大量脂肪、蛋白质，因此提取时需选择适当的提取溶剂，以使提取物中共萃物较少。根据微囊藻毒素易溶于水、甲醇、乙腈及丙酮的特性，本文分别选择水、甲醇、乙腈、丙酮作为提取剂。结果表明，水作为提取溶剂时，杂质较多，基质干扰较大，检测低限无法满足限量要求；用乙腈或丙酮提取，回收率较低；用甲醇提取效果最好，回收率高且基质干扰小，能够满足检测需求。因此，本方法最终选择甲醇作为提取溶剂。

2.4质谱条件确定及裂解机理研究

将提取液以1 mL/min左右的流速通过HLB固相萃取柱，待样液全部流出后，用3 mL水和6 mL 20%甲醇溶液淋洗，弃去全部流出液，用80%甲醇溶液洗脱并定容至2 mL，0.22 μm微孔滤膜过滤，供液相色谱-串联质谱仪分析。

图2　微囊藻毒素可能的质谱裂解机理Fig.2　Possible pyrolysis mechanism of microcystins in mass spectrometer

色谱柱：HSS T3色谱柱，1.8 μm，2.1 mm×100 mm；流速：0.45 mL/min；柱温：50 ℃；进样量：40 μL；流动相：乙腈-0.1%甲酸溶液，梯度洗脱程序见表1。

2.5线性关系及检出限

采用基质溶液配制浓度为2.5 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL一系列标准曲线,并依次进样，以目标化合物的浓度值X为横坐标、相应的峰面积Y为纵坐标，作标准曲线，结果表明，3种微囊藻毒素在2.5～50 ng/mL范围内有良好的线性关系，线性方程及相关系数见表3。

表3　3种微囊藻毒素的回归方程为及相关系数

以实际检测时的信噪比(RSN)为10作为定量限，本方法的检出限为5 ng/g。3种微囊藻毒素混合标样的MRM色谱图见图3。

图3　3种微囊藻毒素混合标样的MRM色谱图Fig.3　The MRM chromatogram of 3 microcystins

2.6回收率与精密度试验

采用样品标准添加法对不含微囊藻毒素的罗非鱼、对虾、牡蛎3种阴性样品基质进行5、10、20 ng/g三水平添加回收试验，实验结果表明回收率范围为85.2%～94.3%，相对标准偏差为4.7%～8.1%，具体结果见表4-6。

表4　罗非鱼中3种微囊藻毒素的平均回收率和相对标准偏差(n=8)

表5　对虾中3种微囊藻毒素的平均回收率和相对标准偏差(n=8)

表6　牡蛎中3种微囊藻毒素的平均回收率和相对标准偏差(n=8)

罗非鱼、对虾、牡蛎样品的3种微囊藻毒素标准添加MRM定量离子色谱图见图3、图4、图5。由图3、4、5可见，经过本方法净化后，谱图杂峰少，净化效果好。

图4　罗非鱼样品中3种微囊藻毒素的MRM色谱图Fig.4　The MRM chromatogram of 3 microcystins in tilapia

图5　对虾样品中3种微囊藻毒素的MRM色谱图Fig.5　The MRM chromatogram of 3 microcystins in prawn

图6　牡蛎样品中3种微囊藻毒素的MRM色谱图Fig.6　The MRM chromatogram of 3 microcystins in oysters

3结论

本方法采用甲醇提取，HLB固相萃取柱净化，建立了水产品中微囊藻毒素的液相色谱-质谱/质谱检测方法，方法的灵敏度高、特异性好、选择性强，能满足水产品中微囊藻毒素的检测要求。

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Determination of Microcystin-LR，Microcystin-RR and

Microcystin-YR in Aquatic Products by means of HPLC-MS-MS

LIANG Zhen-gang1,2,XU Zhi-wei2,CHEN Yi-wei2,DENG Shi-ming1*,XU Li2

(1.College of Marine Sciences,Hainan University,Haikou 570228,China;2.Technology Center of Hainan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau China,Haikou 570311,China)

Abstract:A HPLC-MS-MS method was developed for determining microcystin-LR,microcystin-RR and microcystin-YR in seafoods,the conditions of extraction,purification and the pyrolysis mechanism were also discussed.Methanol was used as the extraction solvent and HLB solid phase extraction column was used as the purifier.External standard method was used to quantify the target compounds with LC-MS-MS.The tested matrix included fish,prawn,oysters.The limits of detection were 5μg/kg.3 spiked levels (0.005 mg/kg,0.010 mg/kg and 0.020 mg/kg) were applied,and the average recoveries and RSDs obtained were ranged from 85.2%～99.3% and 4.7%～8.1%,respectively.As proved,this method satisfies the requirements(including sensitivity,specificity and selectivity) for determining microcystin-LR,microcystin-RR,microcystin-YR.

Key words:microcystin;HPLC-MS-MS;aquatic products

作者简介：梁振纲(1987—)，男，工程师，硕士生，食品药品及相关产品分析，E-mail：362056312@163.com;*通信作者：邓世明，教授，博士，E-mail：dsm701@126.com。

基金项目：海南省科技兴海专项资金项目(XH201407、XH201309)

收稿日期：2015-04-27修回日期：2015-05-26

中图分类号：Q936

文献标志码：A

文章编号：1000-2286(2015)06-1069-07

梁振纲，徐志伟，陈艺玮,等.高效液相色谱-串联质谱法测定水产品中3种微囊藻毒素含量[J].江西农业大学学报，2015，37(6)：1069-1075.