王　艺　帅经纬　李隆玉　罗海莲



雌孕激素对人上皮性卵巢癌裸鼠模型卵巢组织中Bcl-2 表达的影响

王艺帅经纬李隆玉罗海莲

【摘要】目的探讨雌孕激素对人上皮性卵巢癌裸鼠模型卵巢组织中Bcl-2 表达的影响。方法建立人上皮性卵巢癌裸鼠模型,裸鼠随机分为3组：雌激素组(A 组)10只、雌孕激素联合组(B 组)10只、对照组(C组)10只；分别肌肉注射苯甲酸雌二醇注射液0.06 ml、苯甲酸雌二醇注射液0.06 ml联合黄体酮注射液0.06 ml、灭菌油剂0.06 ml，每3天给药，3周后处死裸鼠,剥取肿瘤。应用免疫组织化学法检测Bcl-2 在3组中的表达情况。结果Bcl-2 在3组中阳性表达比较无显著性差异(P>0.05)。结论雌孕激素对人上皮性卵巢癌裸鼠模型卵巢组织中Bcl-2表达无影响。

【关键词】人上皮性卵巢癌；雌激素；孕激素；Bcl-2蛋白

(ThePracticalJournalofCancer,2015,30:0010～0012)

上皮性卵巢癌死亡率居妇科肿瘤首位,此类患者日趋年轻且治疗后的围绝经期症状严重影响其生活质量。激素替代治疗能明显改善围绝经期综合征，但存在的问题是使用激素是否会增加卵巢癌复发、转移的风险尚不明确。国内外大量研究表明，抗凋亡因子 Bcl-2 基因的表达异常与多种恶性肿瘤，特别是雌激素相关恶性肿瘤包括乳腺癌及子宫内膜癌预后密切相关，并可作为此类肿瘤患者病情监测、决定预后的独立因素。本文建立人上皮性卵巢癌裸鼠模型,通过对人上皮性卵巢癌裸鼠模型使用激素与未使用激素的比较，明确雌孕激素的干预是否会改变人上皮性卵巢癌裸鼠模型卵巢组织中Bcl-2的表达。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物BALB/Cnu-nu 小鼠,SPF 级,由国家噬齿类种子中心中国药品生物制品检验所实验动物中心提供,合格证号:SCXK(京) 2005-004。实验动物饲养在江西省药物研究所IVC 笼具内,使用许可证SYXK(赣) 2008-0005。雌性,鼠龄8～10 周龄,体重18～22 g,SPF 级。饲料由江西省饲料生产基地提供,饲料、饮水、垫料均经高压蒸汽灭菌121 ℃,20 min,取出垫料再放入电热鼓风干燥箱干燥后使用。水和饲料自由饮食。按江西省实验动物伦理委员会批准的方案进行实验。

1.1.2实验药物与试剂苯甲酸雌二醇注射液、黄体酮注射液、兔抗鼠 Bcl-2 多克隆抗体购自天津市颧洋生物制品科技有限责任公司(美国 Santa Cruz公司产品)；过氧化物酶标记的免疫组化(streptavidin-veroxidase，Sp)染色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术公司。

1.2方法

1.2.1实验动物模型的构建将人卵巢癌实体瘤皮下移植裸鼠成功的实体瘤剪碎后，通过裸小鼠背部将瘤块置于裸小鼠卵巢上。实现实体瘤原位移植裸鼠模型的建立。重复上述手术,进行实体瘤传代。得到稳定的人卵巢癌实体瘤原位移植裸鼠模型。取8～10周龄裸鼠30只，进行接种，速眠新合剂按0.5 mg/kg剂量腹腔注射麻醉，将已稳定传代的人卵巢癌实体瘤原位移植裸鼠处死、剥离皮下肿瘤，选择生长良好、无坏死、呈淡黄色、鱼肉状瘤组织，剪成1～2 mm大小的组织块，消毒已麻醉裸鼠右肩胛部皮肤，剪一长约5 mm小口，由破口处在皮下分离出一小腔隙，用眼科镊将肿瘤组织块送入腔隙内，缝合，再次消毒，放回IVC 笼具内。接种肿瘤后的裸鼠一周后随机分为3组：雌激素组(A组)10只，雌孕激素联合组(B组)10只、对照组(C组)10只；分别肌肉注射苯甲酸雌二醇注射液0.06 ml、苯甲酸雌二醇注射液0.06 ml、联合黄体酮注射液0.06 ml，灭菌油剂0.06 ml，每3天给药。

1.2.2Bcl-2 表达检测方法标本用 10%甲醛固定，常规石蜡包埋，4 μm 连续切片，采用免疫组织化学 SP 法，严格按试剂盒说明书进行操作。检测 Bcl-2 在裸鼠模型肿瘤组织中的表达，用已知阳性切片作为阳性对照。用 PBS 代替一抗作为阴性对照，DAB 显色，苏木精复染，自来水反复冲洗，梯度酒精脱水干燥，中性树胶封片。

1.2.3结果判断Bcl-2 阳性表达为棕黄色颗粒，主要分布于细胞质。根据每张切片的阳性细胞比例及着色深浅计分，两者乘积为最后结果。参照免疫组织化学免疫反应评分(immunoreactive scroe，IRS)推荐标准，结合染色强度进行评定：基本不着色为 0 分；浅黄色为 1 分；棕黄色为 2 分；棕褐色为 3 分；着色细胞占计数细胞百分率≤5%为 0 分，6%～25%为 1 分，26%～50%为 2 分，51%～75%为 3 分，>75%为 4 分。上述两项乘积为最后得分：0分为阴性(-)，1～3分为弱阳性(+)，4～6分为阳性(++)，7～9 分为强阳性(+++)。

1.3统计学处理

所有数据应用SPSS 13.0软件处理，Bcl-2表达采用多样本率的卡方检验进行统计学处理。

2结果

随机选取5 个视野(×200),应用OLympusCX41生物显微图像分析系统，对Bcl-2基因表达进行分析,以平均灰度值表示,平均灰度值大(染色强度弱、透光度强)，Bcl-2蛋白表达减弱,反之则表达增强。3组Bcl-2蛋白表达情况比较无显著性差异,χ2=1.586，P=0.56，见表1。

表1　3组Bcl-2表达情况比较/例

注：A组和B组分别有1只、2只裸鼠肿瘤组织坏死、脱落、中途死亡；χ2=1.586,P=0.56。

3讨论

卵巢癌是女性生殖系统中死亡率最高的肿瘤，其中上皮性卵巢癌是最常见的卵巢恶性肿瘤，约占90%，平均5年生存率为30%～40%[1-2]。上皮性卵巢癌患者除了忍受各种治疗所带来的痛苦外，还要经历接受治疗后因雌激素降低所引起的围绝经期不适，如潮热多汗、烦躁失眠等。如何提高此类患者治疗后的生存质量问题日益受到重视。激素替代治疗(HRT) 应运而生，对这些患者实施HRT，可以缓解其生理和心理不适，提高其生活质量。但存在的问题是使用激素是否会增加卵巢癌复发、转移的风险尚不明确，其安全性问题一直受到关注。且多数妇科恶性肿瘤，如子宫内膜癌、乳腺癌等的发生发展与雌激素密切相关，因此，HRT[3-6]是否会增加肿瘤的复发和患者的病死率，一直是妇科肿瘤医生顾虑和担心的问题。

雌激素致肿瘤作用的确切机制目前尚不清楚，揭示雌激素介导的肿瘤发生途径，有助于从根本上解决雌激素的潜在致癌作用。国内外大量研究表明[7-9]，抗凋亡因子 Bcl-2 基因的表达异常与多种恶性肿瘤，特别是雌激素相关恶性肿瘤包括乳腺癌及子宫内膜癌预后密切相关，并可作为此类肿瘤患者病情监测、决定预后的独立因素。Bcl-2 作为1种重要的凋亡调控基因，不仅能够抑制细胞凋亡，延长细胞寿命，而且参与细胞增生的调控，它可以调控细胞由G0期向S期转换的时间。Bcl-2在肿瘤的形成及肿瘤多药耐药的形成中也起着重要的作用，因此通过对 Bcl-2 基因不断深入的研究，可为肿瘤治疗提供新的思路和启示。

本实验进行了Bcl-2的半定量研究，与对照组比较，苯甲酸雌二醇注射液组和苯甲酸雌二醇注射液联合黄体酮注射液组Bcl-2基因在肿瘤组织中的表达无显著性差异。我们的研究结果表明，雌孕激素对人上皮性卵巢癌裸鼠模型卵巢组织中Bcl-2的表达无影响。

此为动物实验，人和动物有物种差别，药物在鼠体内的代谢和人可能存在一定差异，但移植瘤是人上皮性卵巢癌，其结果接近人体情况[10]，本研究从基因学水平这个层次，为雌孕激素在卵巢癌患者中应用提供了研究基础，在基因学上无影响，生物学上有无影响，目前还没研究，但需进行大样本前瞻性临床研究才能最后证实雌孕激素联合应用在卵巢癌患者中的安全性。

参考文献

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(编辑：吴小红)

The Effects of Estrogen and Progesterone on Expression of Bcl-2 in Ovarian Tissue of Human Epithelial Ovarian Cancer Nude Mouse Model

WANGYi,SHUAIJingwei,LILongyu,etal.DepartmentofOncology，JiangxiMaternityandChildHealthCareHospital,Nanchang,330006

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of estrogen and progesterone on Bcl-2 expression in ovarian tissue of human epithelial ovarian cancer nude mouse model.MethodsHuman epithelial ovarian cancer nude mouse model were set up,and mice were randomly divided into 3 groups:the estrogen group (group A) 10 rats,estrogen and progestin combination group (group B) 10 rats，the control group (group C) 10 rats；they received intramuscular injections of estradiol benzoate 0.06 ml,0.06 ml estradiol benzoate injection combined with progesterone injection 0.06 ml,sterilization oil 0.06 ml,respectively,administered every 3 days,the mice were killed after 3 weeks,and tumors were stripped.Immunohistochemistry was used to detect expression of Bcl-2 in the 3 groups.ResultsBcl-2 expression in the 3 groups has no significant difference (P> 0.05).ConclusionEstrogen and progesterone had no effect on the expression of Bcl-2 in ovarian tissue of human epithelial ovarian cancer nude mouse model.

【Key words】Human epithelial ovarian cancer；Estrogen；Progesterone；Bcl-2 protein

(收稿日期2014-03-14修回日期 2014-06-01)

中图分类号：R737.31

文献标识码：A

文章编号：1001-5930(2015)01-0010-03

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2015.01.003

通讯作者：李隆玉

基金项目：江西省自然科学基金项目(编号：20114BAB205013)
作者单位:330006 江西省妇幼保健院