董 静，聂颖杰，李三红*南京市口腔医院（南京大学医学院附属口腔医院），南京 0008；南京优科生物医药有限公司，南京0000

注射用头孢曲松钠他唑巴坦钠含量测定方法的研究

董 静1，聂颖杰2，李三红1*
1南京市口腔医院（南京大学医学院附属口腔医院），南京 210008；2南京优科生物医药有限公司，南京210000

目的：建立同时测定注射用头孢曲松钠他唑巴坦钠中头孢曲松和他唑巴坦含量的方法。方法：色谱柱为DIKMA Diamonsil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相A为0.03 mol·L-1磷酸二氢钾溶液-10%四丁基氢化铵溶液（995∶5），用磷酸调pH至3.0，流动相B为乙腈-甲醇（1∶2），以A∶B=70∶30作为流动相；波长为230 nm；流速为1.0 mL·min-1；柱温为30 ℃。结果：头孢曲松和他唑巴坦之间的分离度为2.89，头孢曲松和反式头孢曲松的分离度为12.41；经酸、碱、氧化、高温和光照破坏试验表明，头孢曲松和他唑巴坦与其它杂质的分离度良好。头孢曲松和他唑巴坦在线性范围内进样量和峰面积呈良好的线性关系，相关系数分别为1和0.9999；平均加样回收率分别为100.3%和99.5%，RSD分别为0.90%和0.66%。结论：该方法操作简便，专属性和耐用性好，结果准确，可同时测定注射用头孢曲松钠他唑巴坦钠中头孢曲松和他唑巴坦的含量。

高效液相色谱法；头孢曲松；他唑巴坦；含量测定

注射用头孢曲松钠他唑巴坦钠是头孢曲松和他唑巴坦按3∶1（w/w）组成的复方制剂。头孢曲松钠为第三代头孢菌素类抗生素，能够抑制细菌细胞壁合成而起到杀菌作用，但易被β-内酰胺酶水解而失去活性；他唑巴坦钠对β-内酰胺酶有抑制作用，两者联用发挥协同抗菌作用，适用于对头孢曲松耐药、对本复方敏感的β-内酰胺酶细菌引起的中重度感染。根据Mohnarin年度报告：我国临床分离菌耐药性较为严重，特别是超广谱β-内酰胺酶（extended spectrum beta-lactamases，ESBLs）的肠杆菌科细菌，在临床上十分普遍。

注射用头孢曲松钠他唑巴坦钠可有效克服因ESBLs引起的耐药，并能阻断或延缓耐药的继续发展，是一个安全、有效，临床运用广泛的复方抗生素[1]。原标准采用反相高效液相色谱法测定了两者的含量，但未对反式头孢曲松进行有效的分离，影响了含量测定的准确性。

本文重新建立反相高效液相色谱法同时测定头孢曲松和他唑巴坦含量的方法，对酸、碱、氧化和高温破坏后的杂质和两个主峰的分离情况进行了研究，规定了头孢曲松和反式头孢曲松的分离度，提高了含量测定的准确性。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-1260高效液相色谱系统 （含1260 Quat PumpVL泵，1260ALS自动进样器，1260TCC控温箱，1260VWD紫外检测器和OpenLAB色谱工作站，安捷伦）；AL204型电子分析天平（德国梅特勒仪器公司）；BP211D型电子分析天平 （德国赛多利斯仪器公司）；320-SpH计〔梅特利－托利多仪器（上海）有限公司〕。

1.2 试药

头孢曲松对照品（纯度83.7%，中国药品生物制品检定所，批号：130480-200903）；他唑巴坦对照品（纯度99.1%，中国药品生物制品检定所，批号：130511-200402）；反式头孢曲松对照品 （纯度：99.4%，仅供HPLC系统适用性实验用，中国药品生物制品检定所，批号：130660-201001）；注射用头孢曲松钠他唑巴坦钠粉针剂（3∶1）（南京优科制药有限公司，批号：20120401、20120402、20120403）。

磷酸二氢钾和10%四丁基氢化铵为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；乙腈、甲醇为色谱纯，购自Merck公司；其余试剂为分析纯；水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件[2-6]

色谱柱为DIKMA-C18柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A为0.03 mol·L-1磷酸二氢钾溶液-10%四丁基氢化铵溶液（995∶5）的混合液（4.08 g磷酸二氢钾加5 mL 10%四丁基氢氧化铵溶液，加水稀释至1000 mL，用磷酸调节pH为3.0），流动相B为甲醇-乙腈=2∶1（v/v）的混合溶液，以A∶B=70∶30（v/ v）；柱温为30℃；波长为230 nm；流速为1.0 mL· min-1；进样量为10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 空白对照溶液 以流动相做为空白对照溶液。

2.2.2 系统适用性溶液 取头孢曲松对照品、反式头孢曲松对照品适量，加流动相溶解并稀释制成每1 mL中约含头孢曲松1.5 mg、反式头孢曲松15 μg的溶液，作为系统适用性溶液。

2.2.3 对照品溶液 取头孢曲松、他唑巴坦对照品适量，精密称定，加流动相溶解并稀释制成每1 mL分别含头孢曲松1.5 mg、他唑巴坦0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。

2.2.4 供试品溶液 精密称取100 mg（相当于头孢曲松75 mg，他唑巴坦25 mg），置50 mL量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液。

2.3 系统适用性

精密量取空白对照溶液、系统适用性溶液各10 μL注入液相色谱仪，记录色谱图。系统适用性溶液色谱图中头孢曲松和他唑巴坦的理论塔板数分别为5556和8136；分离度分别为14.51和2.89；色谱图中头孢曲松和反式头孢曲松的分离度为12.41；空白对照对检测没有影响。色谱图见图1。

2.4 专属性试验

取注射用头孢曲松钠他唑巴坦钠适量，分别进行酸、碱、高温、氧化和光破坏后，照供试品溶液制备方法制备样品溶液。考察在现有分析条件下降解产物和头孢曲松与他唑巴坦主峰的分离度。结果：本品经碱、氧化、高温、光照破坏后降解产物有明显增加，酸破坏后降解产物没有明显增加，降解产物与头孢曲松、他唑巴坦能完全分离。见图2。

2.5 线性范围

取头孢曲松对照品和他唑巴坦对照品适量，精密称定，加流动相溶解并稀释制成约含头孢曲松1.5 mg·mL-1、他唑巴坦0.5 mg·mL-1的溶液，作为线性对照品溶液。分别取溶液2、5、8、10、12、15 μL依次注入液相色谱仪，记录色谱图。以进样量（X，μg）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，进行线性回归。头孢曲松回归方程：Y=2765.3X+66.19，r=1，线性范围为3.0～22.5 μg；他唑巴坦回归方程：Y=342.78X+ 16.031，r=0.9999，线性范围为1.0～7.5 μg。

2.6 进样精密度试验

取线性试验项下的对照品溶液，精密量取10 μL依次注入液相色谱仪，连续进样6次，记录峰面积，头孢曲松和他唑巴坦峰面积的RSD分别为0.82%和0.51%。试验结果表明，本法进样精密度良好。

2.7 定量限考察

取头孢曲松对照品适量，精密称定，加流动相溶解并稀释制成约含头孢曲松1.5 mg·mL-1的溶液，逐级稀释，进行测定，按信噪比10∶1，确定头孢曲松的最小定量限为0.15 ng。

取他唑巴坦对照品适量，精密称定，加流动相溶解并稀释制成约含他唑巴坦0.5 mg·mL-1的溶液，逐级稀释，进行测定，按信噪比10∶1，确定他唑巴坦的最小定量限为1.00 ng。

2.8 重复性试验

取本品（批号：20120401）适量，精密称定，加流动相溶解并制成每毫升含头孢曲松1.5 mg、含他唑巴坦0.5 mg的溶液，作为供试品溶液，共配制6份，进样测定。结果按无水物计，头孢曲松和他唑巴坦的含量分别为710 μg·mg-1和233 μg·mg-1，RSD分别为0.97%和1.52%。

2.9 稳定性试验

取本品（批号：20120401），加流动相制成每毫升含头孢曲松1.5 mg、含他唑巴坦0.5 mg的溶液，作为供试品溶液，置于温度为5℃自动进样器，分别于0、1、2、4、6、8、10、12 h进样测定。头孢曲松和他唑巴坦峰面积RSD分别为0.65%和0.59%，表明供试品溶液在5℃条件下12 h内相对稳定。

2.10 加样回收率试验

按照供试品溶液80%、100%、120%的浓度配制高、中、低三个样品溶液，每个溶液配制3份，进样测定，计算回收率。结果见表1。头孢曲松和他唑巴坦的平均回收率分别为100.3%和99.5%，RSD（n= 9）分别为0.90%和0.66%。

2.11 耐用性考察

分别考察了盐用量、柱温、流速、pH值、四丁基氢氧化铵用量、流动相比例和波长在±5%范围内变化及采用不同的色谱柱对本品的含量测定的影响。上述不同条件下，头孢曲松和他唑巴坦的平均含量分别为101.7%和99.6%，RSD（n=3）分别为0.17%和0.17%。表明本法耐用性良好，微调盐用量、柱温、流速、pH值、四丁基氢氧化铵用量、流动相比例和波长及更换不同厂家的色谱柱，均对本品含量测定结果无影响。

2.12 注射用头孢曲松钠他唑巴坦钠（3∶1）含量测定

取注射用头孢曲松钠他唑巴坦钠（3∶1）三批（批号：20120401、20120402、20120403），按“2.1”项下色谱条件分别测定头孢曲松和他唑巴坦含量，见表2。

表1 回收率试验结果

表2 含量测定结果（n=6）

3 讨 论

参考《中国药典》他唑巴坦质量标准、《美国药典》标准[2-3]，对测定方法进行了筛选，分别试用了中国药典方法和美国药典的方法，根据系统适用性结果，最终以中国药典方法为基础建立了上述含量测定的方法。中国药典方法和调整后的方法结果对比见表3。

在选择检测波长时，因为要同时测定头孢曲松和他唑巴坦的含量，检测波长需要满足两个成分均有吸收的条件。我们分别取头孢曲松对照品、他唑巴坦对照品适量，加流动相配制成10 μg·mL-1的溶液，照紫外分光光度法，在190～400 nm波长范围进行紫外扫描，头孢曲松的最大吸收波长为245 nm，由于他唑巴坦在245 nm处无吸收，且两组分的配比为3∶1，故选择他唑巴坦吸收较强的230 nm作为检测波长。

本文建立的注射用头孢曲松钠他唑巴坦钠含量测定的色谱条件，是基于头孢曲松、他唑巴坦与主要杂质分离度试验及破坏性试验等方法学研究上得到的优化结果，其灵敏度高、专属性强、操作简便，能够同时测定本品中头孢曲松和他唑巴坦的含量。

表3 中国药典方法和调整后的方法结果对比

[1] 肖永红，沈 萍，魏泽庆，等.Mohnarin 2011年度全国细菌耐药监测 [J].中华医院感染学杂志，2012，22（22）：4946-52.

[2] 中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典（二部）[S].北京：中国医药科技出版社，2010：附录194-5.

[3] 美国药典中文版第2卷 [S].北京：化学工业出版社，USP34-NF29：1924-5.

SimultaneousDetermination ofCeftriaxoneand Tazobactam Contentin Ceftriaxone Sodium and Tazobactam Sodium(3∶1)for Injection

DONG Jing1,NIE Ying-jie2,LI San-hong1*
1Nanjing Stomatological Hospital,Medical School of Nanjing University,Nanjing 210008;2Nanjing Yoko Pharmaceutical Co.Ltd,Nanjing 210000

Objective:To establish a new method for simultaneous determination of ceftriaxone and tazobactam contents in ceftriaxone sodium and tazobactam sodium (3∶1)for injection.Methods:A DIKMA Diamonsil C18column (4.6 mm×250 mm,5 μm)was used with the mobile phase consisted of mobile phase A∶mobile phase B (70∶30)at a flow rate of 1.0 mL·min-1,and the detection wavelength was set at 230 nm. The mobile phase A consisted of 0.03 mol·L-1potassium dihydrogen phosphate and 10%tetrabutyl ammoni-um hydroxide(995∶5,pH 3.0),the mobile phase B consisted of acetonitrile and methanol(1∶2).The column temperature was 30℃.Results:Ceftriaxone and tazobactam were well-separated,and the separation degree between them was 2.89.The separation degree between ceftriaxone and trans-ceftriaxone was 12.41.Ceftri-axone and tazobactam were separated very well from their impurities under the condition of acid,alkali, oxidation,high temperature or light damage.Ceftriaxone and tazobactam showed good linear relationship be-tween sampled amount and peak area in the linear range of calibration curve,and the correlation coeffi-cients were 1 and 0.9999.The average recoveries were 100.3%and 99.5%,RSD were 0.90%and 0.66%. Conclusion:This method is simple,specific,accurate and can be used for simultaneous determination of ceftriaxone and tazobactam in the ceftriaxone sodium and tazobactam sodium(3∶1)for injection.

High performance liquid chromatography (HPLC);Ceftriaxone;Tazobactam;Content deter-mination

R927.2

A

1673-7806（2015）02-131-04

董静，女，主管药师 E-mail:tokyodj@yeah.net

*通讯作者李三红，女，副主任中药师 E-mail:lshaaaa@163.com

2014-10-20

2014-11-13