徐炳国，王树卿，刘程伟**，高玲娟

1黑龙江牡丹江市肿瘤医院腹部外科，牡丹江 157009；2黑龙江佳木斯大学附属第一医院腹部外科，佳木斯 154007；3江苏省南京市妇幼保健院检验科，南京 210004

替吉奥单药对幽门螺杆菌相关性胃癌中gC1qR的表达影响*

徐炳国1，王树卿2，刘程伟2**，高玲娟3**

1黑龙江牡丹江市肿瘤医院腹部外科，牡丹江 157009；2黑龙江佳木斯大学附属第一医院腹部外科，佳木斯 154007；3江苏省南京市妇幼保健院检验科，南京 210004

目的：探讨替吉奥单药对胃癌中幽门螺杆菌（H.pylori，Hp）的感染及球状C1q受体基因（gC1qR）表达的影响。方法：以胃癌、胃炎病例组织及胃癌细胞系为研究对象，采用实时定量聚合酶链反应（Real time PCR）检测gC1qR mRNA表达水平；采用Hp DNA PCR方法，对胃窦部组织标本进行Hp水平检测；流式细胞技术进行细胞凋亡的检测及transwell实验进行细胞侵袭能力的检测。结果：在40对配对组织中有33对肿瘤组织gC1qR mRNA表达低于配对的胃炎病例组织；替吉奥单药可诱导gC1qR基因表达，抑制胃癌细胞Hp感染，同时增加胃癌细胞的凋亡率及降低胃癌细胞侵袭能力。结论：替吉奥单药诱导gC1qR基因表达，影响Hp对胃癌发生发展，是治疗胃癌的首选药物。

替吉奥单药；gC1qR基因；幽门螺杆菌（H.pylori，Hp）；胃癌

胃癌目前是全球最常见的恶性肿瘤之一，居各类恶性肿瘤死亡率之首[1]。胃癌的病因学研究已经证实，幽门螺杆菌（H.pylori，Hp）感染是导致胃癌及其相关病变的首要因素[2]，因此深入研究影响Hp感染对胃癌发生的影响及其作用机制开始成为预防医学领域疾病早期防治的一个热点研究内容。球状C1q受体（Receptor for the globular heads of C1q，gC1qR）是各种哺乳动物细胞（红细胞除外）中均存在的一种受体蛋白，主要以C1q-gC1qR复合体形式位于线粒体表面，影响线粒体功能[3]，调控细胞的生物学特征[4]。目前，胃癌无统一的治疗方案，其化疗方案效果也不尽相同。临床治疗显示替吉奥单药治疗晚期胃癌可以明显提高有效率及远期生存率，本研究就替吉奥单药治疗晚期胃癌机制做进一步探讨。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选择2011年1月～2013年12月在牡丹江市肿瘤医院门诊及住院的患者，年龄在35～69岁，受试者分为两组：①胃炎组40例，胃镜检查的患者；②胃癌组，40例。采用实时定量聚合酶链反应（Real time PCR）检测gC1qR mRNA表达水平；采用Hp DNA PCR方法，对胃窦部组织标本进行Hp水平检测，确定gC1qR基因与Hp感染、胃癌的相关性。

1.2 仪器与试剂

Prime 7300荧光定量PCR仪 （美国ABI公司）。Trizol试剂、RPMI 1640细胞培养基、转染试剂盒均购自 Invitrogen公司；Real-time PCR试剂Master Mix购自 ABI公司；特异性引物和探针（Taqman探针、FAM标记）由杭州赫贝公司合成。

1.3 胃癌细胞培养与分组

胃癌细胞株MKN-28（人胃癌高分化腺癌细胞株）由杭州赫贝生物技术有限公司提供。细胞贴壁生长，培养于 （含15%胎牛血清，100 U·mL-1青霉素，100 U·mL-1链霉素，非必需氨基酸10 mL·L-1及MEM，pH 7.2）培养液中，每50 mL培养瓶中加入4 mL完全营养液，置于37℃、5%CO2孵箱中，每1～2天换液一次。将培养的胃癌细胞株分做2种处理：①实验组：取培养的胃癌细胞系，50%～70%融合，以1×107个活菌的Hp菌液与胃癌细胞共同培养24 h，以40 mg·m-2替吉奥单药作用于Hp感染胃癌细胞；②对照组：取培养的胃癌细胞系，50%～70%融合，以1×107个活菌的Hp菌液与胃癌细胞共同培养24 h，不施加替吉奥单药作用于Hp感染胃癌细胞。

1.4 实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）

gC1qR引物与探针分别为：上游5’-AAT CAC ACG GTA GAC ACT GAA ATG CC-3’，下游5’-CAT CAT CCC ATC TAA AAT GTC CCC TG-3’，探针5’-TGC TCC AGT TCA ACC AAC GTC CTT CTC-3’。βactin引物与探针分别为：上游5’-TCA CCC ACA CTG TGC CCA TCT ATG A-3’，下游5-CAT CGG AAC CGC TCA TTG CCG ATA-3’，探针5’-ACG CGC TCC CCC ATG CCA TCC TGC GT-3’。PCR反应体系为20 μL含1×TaqMan Universal PCR Mas-ter Mix（ABI）、0.1 μmol·L-1荧光标记探针、引物各0.2 μmol·L-1。实时荧光 PCR反应在 ABI Prime 7300定量PCR检测仪上进行，反应参数为50℃/2 min，95℃/3 min，95℃/15 s，60℃/1 min，40个循环，在60℃进行单点荧光检测。选择荧光检测模式FAM荧光，对于实验数据，按以下公式进行计算：2-ΔΔCT=2-（CT.gC1qR-CT.actin）Timex+（CT.gC1qR-CT.actin）Time0

1.5 胃癌细胞凋亡检测

收集细胞制成细胞悬液，调整细胞数为5×106/mL。500～1000 r·min-1离心5 min，弃去培养液。用预冷、4℃无菌的PBS充分洗涤细胞两次，用250 μL结合缓冲液重新悬浮细胞。取100 μL的细胞悬液于5 mL流式管中，加入5 μL Annexin V-异硫氰酸荧光素（Fluorescein Isothiocyanate，FITC）和10 μL 20 μg· mL-1的碘化丙啶（Propidiumiodide，PI）溶液，混匀后室温下避光孵育10 min。孵育后加入400 μL结合缓冲液，立即上流式细胞仪分析（实验须在1 h内完成）。

1.6 胃癌细胞侵袭实验

细胞体外侵袭能力的测定在重建基底膜的8 μm孔径的聚碳酯膜transwell小室中进行。上室内加入含5×106/mL的实验组/对照组胃癌细胞重悬液100 μL；下室内为具有趋化作用的无血清培养成纤维细胞培养液。上下室之间以聚碳酸酯膜-Matrigel来模拟体内细胞外基质环境，从而考察细胞穿透细胞外基质向外浸润和扩展的能力。37℃培养24 h后，将上室附着的细胞以湿棉签拭去，对膜下方细胞行常规HE染色，光学显微镜观察。

1.7 统计学处理

2 结 果

2.1 胃癌组织中gC1qR mRNA水平的表达与幽门螺杆菌的关系

33例（82.5%）胃癌组织中gC1qR mRNA表达水平下调，胃炎组织中5例（12.5%）gC1qR mRNA表达水平下调；gC1qR基因在胃癌组织中的表达明显低于胃炎组织，两者之间差异具有显著性（P＜0.01）。同期检测Hp感染率，由图1、表1可见，胃癌组Hp感染率与胃炎组相比差异有统计学意义（P＜0.01）。

图1 实时荧光定量PCR扩增gC1qR及Actin示意图

表1 2组gC1R mRNA表达和Hp感染率的检测（±s）

表1 2组gC1R mRNA表达和Hp感染率的检测（±s）

注：与胃炎组比较，**P＜0.01

组别gC1R mRNA Hp（%）胃癌组0.22±0.04**72.4**胃炎组0.65±0.07 33.3

2.2 替吉奥单药对胃癌细胞的凋亡和侵袭能力

替吉奥单药作用于Hp感染胃癌细胞 （实验组），结果显示，与未用药组（对照组）比较，gC1qR表达显著升高，Hp含量明显减少，且胃癌细胞的凋亡率明显增加，而胃癌细胞的侵袭能力显著下降，2组比较存在显著差异（P＜0.01）。见图2、表2。

图2 流式细胞仪检测胃癌细胞凋亡示意图

表2 2组胃癌细胞的凋亡和侵袭细胞数比较（±s）

表2 2组胃癌细胞的凋亡和侵袭细胞数比较（±s）

注：与对照组比较，**P＜0.01

组别实验组对照组gC1R mRNA Hp 凋亡侵袭0.42±0.03**0.12±0.02**0.87±0.08**25.46±2.05**0.21±0.03 0.76±0.04 0.34±0.04 64.39±1.04

3 讨 论

国际癌症研究机构（IARC）组织将Hp列为I类致癌因子，Hp感染人群发生胃癌的风险是非感染人群的6倍，提示Hp感染是胃癌恶变的重要危险因素。在前期研究中，对牡丹江市肿瘤医院胃窦部组织及胃黏膜组织病变者进行核酸水平的Hp检测，也发现慢性浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎和胃窦部不典型增生病变组织中，Hp DNA含量分别为正常胃组织的2.68、2.95、4.52倍。

胃癌的发生是多因素、多阶段、多基因变异综合作用的过程，迄今有关Hp基因致癌机理的研究已有较多文献报道，如：激活巨噬细胞游走抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF），从而促进胃上皮细胞增殖并抑制凋亡[5]；调控Cas-pase-3基因抑制胃癌细胞凋亡[6]；调控线粒体功能导致胃癌细胞无限增殖等机制，是近年来提出的有关Hp致癌的新理论[7]。本研究发现补体受体gC1qR（补体C1q受体）可以通过锚定在线粒体上影响滋养层细胞的功能，从而介导滋养层细胞的凋亡[8]。本研究中，采用Real time PCR检测胃病变组织中gC1qR mRNA表达，结果发现，胃癌组织中gC1qR mRNA的表达显著下调。上述结果提示gC1qR是Hp-胃癌细胞关系研究的新线索。

以化疗为主的非手术综合治疗是治疗晚期癌症的主要手段，可明显改善晚期胃癌患者的生活质量，延长生存期。据统计，替吉奥单药治疗晚期胃癌有效率为26.0%～49.0%，鉴于此，我们将替吉奥单药作用与体外培养的Hp感染的胃癌细胞株，发现其诱导gC1qR基因表达，抑制Hp感染，同时胃癌细胞凋亡率明显增加，且侵袭能力显著下调，本研究从体外实验为替吉奥单药治疗胃癌提供全新理论。

[1] Hyun MH,Lee CH,Kim HJ,et al.Systematic review and meta-analysis of robotic surgery compared with conventional laparoscopic and open resections for gas-tric carcinoma[J].Br J Surg,2013,100(12):1566-78.

[2] Osman MA,Bloom GS,Tagoe EA.Helicobacter pyloriinduced alteration of epithelial cell signaling and polarity: a possible mechanism of gastric carcinoma etiology and disparity[J].Cytoskeleton(Hoboken),2013,70(7):349-59.

[3] Gao LJ,Gu PQ,Fan WM,et al.The role of gC1qR in regulating survival of human papillomavirus 16 onco-genes-transfected cervical cancer cells[J].Int J Oncol, 2011,39(5):1265-72.

[4] Kim JA,Wei Y,Sowers JR.Role of mitochondrial dysfunc-tion in insulin resistance[J].Circ Res,2008,102(4):401-14.

[5] He XX,Yang J,Ding YW,et al.Increased epithelial and serum expression of macrophage migration inhibito-ry factor (MIF)in gastric cancer:potential role of MIF in gastric carcinogenesis[J].Gut,2006,55(6):797-802.

[6] Wu IC,Wu MT,Chen YK,et al.Apoptotic effect of Hel-icobacter pylori on oesophageal squamous-cell carcinoma cells in vitro[J].Eur J Clin Invest,2008,38(10):760-5.

[7] Zhang H,Fang DC,Lan CH,et al.Helicobacter pylori infection induces apoptosis in gastric cancer cells through the mitochondrial pathway[J].J Gastroenterol Hepatol,2007,22(7):1051-6.

[8] 马培奇.抗肿瘤新药替吉奥钾研究进展[J].中国医药导刊，2007，9（6）：499-502.

Effect of Compound Tegafur and Oteracil Potassium Sustained Capsules (S-1) on the Expression of gC1qR in H.Pylori Associated Gastric Cancer*

XU Bing-guo1,WANG Shu-qing2,LIU Cheng-wei2**,GAO Ling-juan3**
1Department of Abdominal Surgery,Tumour Hospital of Mudanjiang City,Mudanjiang Heilongjiang 157009;2Department of Abdominal Surgery,First Affiliated Hospital of Jiamusi University,Jiamusi Heilongjiang 154009;3Department of Clinical Laboratory,Nanjing Maternity and Child Health Care Hospital,Nanjing 210004

Objective:To investigate the effect of compound tegafur and oteracil potassium sustained capsules (S-1)on the expression of gC1qR gene and H.pylori (Hp)in gastric cancer.Methods:The expression of gC1qR mRNA and Hp was detected by Real time PCR and Hp DNA PCR in 40 matched pairs of gastritis and gastric cancer specimens.In vitro experiment,the apoptosis of gastric cancer cell line-treated with S-1 was assessed by flow cytometry,meanwhile,the migration of gastric cancer cell was detected via transwell assay.Results:The levels of gC1qR mRNA were significantly decreased and Hp was significantly increased in gastric cancer specimens.S-1 could induce the overexpression of gC1qR and inhibit the infection of Hp,and induce the apoptosis and inhibit the migration of gastric cancer cell. Conclusions:These resultsindicate thatS-1 inducesthe expression ofgC1qR,and effectsthe development of Hp-infected gastric cancer,S-1 is the first selective drug for controlling gastric cancer.

Compound Tegafur and Oteracil Potassium Sustained Capsules (S-1);gC1qR gene;H. pylori;Gastric cancer

R963；R979.1

A

1673-7806（2015）02-104-03

南京市医学科技发展基金（No.201308041）；南京市科技计划项目（No.201303019）

徐炳国，男，副主任医师 E-mail:xubingguo1973@163.com

**通讯作者刘程伟，男，主任医师 E-mail:njsctgzgq@163.com高玲娟，女，副主任技师 E-mail:gaolingjuan@njmu.edu.cn

2014-11-19

2014-12-08