李 然 许记刚 吴 暄 姬高升 杨 鑫 王红宁

(四川大学生命科学学院,动物疫病防控与食品安全四川省重点实验室,生物资源与生态环境教育部重点实验室,“985工程”西南资源环境与灾害防治科技创新平台,四川成都 610064)

禽传染性支气管炎病毒M41株反向遗传株的构建

李 然 许记刚 吴 暄 姬高升 杨 鑫 王红宁*

(四川大学生命科学学院,动物疫病防控与食品安全四川省重点实验室,生物资源与生态环境教育部重点实验室,“985工程”西南资源环境与灾害防治科技创新平台,四川成都 610064)

禽传染性支气管炎病毒是目前危害禽养殖业的重大传染病之一。由于病毒基因组大、操作困难，给研究其基因组结构开发有效的疫苗带来了困难。本研究在对IBV M41毒株全基因组序列测序的基础上用DNAStar软件的MapDraw程序分析酶切位点的分布情况，将全基因组分为14段分段扩增。采用Primer6设计含No See’m酶切位点，在5’端引入T7启动子核心序列的引物，分段克隆于PMD19-T载体，通过引入的“No See’m式”Bsa I和BsmB I酶切位点，将亚克隆体外拼接成基因组全长cDNA。再通过5’端引入的T7启动子核心序列对基因组全长cDNA进行体外转录，使用电击的方法将全长转录物转染BHK-21细胞，转染后转入SPF鸡胚培养，鉴定成功获得了IBV M41拯救株。为研究IBV强毒株的致病机理、毒力位点及IBV新型疫苗的研究提供了参考，奠定了基础。

IBV M41株 反向遗传

传染性支气管炎（IB）又称为禽传染性支气管炎，是由冠状病毒科的传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis Virus，IBV）引起的一种鸡的常见的急性、高度传染性疾病，是危害养禽业的重大传染病之一。以呼吸道症状、产蛋鸡产蛋下降、蛋品质下降、肾脏病变及胃肠道病变为主要特征（Saif Y M等，2005；Cavanagh 等，2003）。目前，IBV广泛分布，不同毒株在组织嗜性及致病性上存在较大差异，血清型复杂，目前全世界已经发现几十种IBV血清型，由于血清型众多，不同血清毒株交叉保护弱，新的变异毒株不断出现，导致禽传染性支气管炎不断爆发（Zou N L等，2010；Kulkarni A B 等，2010）。每年造成的经济损失超过十亿元，当前尚无治疗IB的特效药，疫苗免疫成为IBV防控的主要手段（王红宁，2000）。

对RNA病毒而言，反向遗传学技术主要指全长cDNA感染性克隆技术，包括病毒基因组全长cDNA的克隆拼接技术和由全长cDNA转录获得感染性转录体制备技术。该技术能在病毒DNA水平上对其进行人工操作，解决了RNA病毒基因组难以操作的难题，从而为RNA 病毒的基因复制与表达调控机理研究，新疫苗的研制等提供了强有力的技术手段。自1978年Taniguchil首次对RNA病毒噬菌体Qβ进行反向遗传操作（Taniguchi and Weissmann，1978）以来，已有大量RNA病毒反向遗传操作的报道。禽冠状病毒传染性支气管炎病毒IBV的反向遗传操作主要集中在Beaudette株反向遗传研究。Casais R等（2001）痘苗病毒载体成功建立了IBV反向遗传操作技术，发现S蛋白是IBV组织嗜性的决定子，也是主要免疫原性基因。Casais R等（2005）发现基因5是IBV复制非必需的基因。Hudgson T等（2006）在Casais前期的工作基础上，对IBV的基因3（3ab）的功能进行了研究，结果发现基因3也是复制非必需的基因。美国学者Youn S等（2005）和新加坡学者Fang S等（2007）分别也分别建立了IBV的反向遗传体系。在国外学者对Beaudette株反向遗传研究的基础上目前我国也已经成功构建了H120的反向遗传（Ying Shun Zhou，2013）。国内外对IBV的研究均集中于弱毒株的反向遗传操作，但是对强毒株的反向遗传构建，及毒力位点致病机理的研究有待完善，因此本研究在实验室前期工作的基础上选择IBV M41株作为研究对象，建立IBV强毒株的反向遗传操作为后续进一步研究病毒的分子致病机理，重组疫苗等奠定基础。

1 材料

1.1 毒株

IBV M41株中国兽医药品监察所提供，由四川大学动物疫病防控与食品安全四川省重点实验室保存。

1.2 工具酶及主要试剂

限制性内切酶BSaI、BsmBI（NEB）；KOD-plus高保真酶（TOYOBO）；PMD19-T、DH5α、T4 DNA Ligase（Takara）；引物由上海生工生物公司合成。

2 方法

2.1 IBV M41株全基因组的分段扩增

在对IBV M41毒株全基因组测序的基础上，用DNASTAR对其进行酶切位点的分析后将全基因组分成14段。用Primer 6设计含有No See’m酶切位点的扩增引物，在全基因组5'UTR端引入T7启动子，在全基因组3'端引入Poly（A）尾。引物由上海生工生物工程公司合成。

Trizol法从含IBV M41株的鸡胚尿囊液中提取总RNA，反转录成cDNA，14个片段分别用高保真酶以cDNA为模板进行PCR扩增。将各个目的片段纯化后分别与PMD19-T载体连接、将获得的连接产物转化到DH5α感受态中，在含有氨苄西林的IPTG/X-gal固态平板上37℃过夜培养，挑取阳性克隆（3～5个）进行测序正确无误后保存菌种。

2.2 重组质粒的提取、目的cDNA片段的酶切回收

将鉴定后保存的正确无误的菌种接种于200ml具有氨苄抗性的LB培养基中37℃过夜培养11～14h，用碱裂解法提取质粒、用聚乙二醇法纯化。

分别对载有F1～F14的质粒进行酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，目的片段切胶回收，用核酸蛋白仪测定浓度。

2.3 全长cDNA的克隆拼接和感染性转录体的获得

（1）在T4连接酶体系中，将F1-F4；F4-F8；F9-11；F12-14分别以等摩尔比连接。琼脂糖电泳回收纯化得到四个长度分别为6.84K、6.87K、6.86K、6.95K的1/4目的片段。

（2）将四个四分之一片段按照等摩尔比用T4连接酶连接24h获得全长、抽提浓缩。用mMESSAGE mMACHINE Ultra T7 Kit体外转录试剂盒体外转录获得具有感染性的全长RNA。

2.4 反向遗传株M41-R株的鉴定

2.4.1 拯救株致病性及EID50测定

SPF鸡胚孵化至10日龄；将IBV依次作10倍稀释，进行鸡胚尿囊腔接种，每个稀释度接种0.2ml；作5个重复，同时设正常鸡胚对照。置37℃培养，弃去24h内死亡胚，再孵化7d后观察。按Reed-Muench法计算EID50。

2.4.2 HA 测定

将M41-R鸡胚尿囊液用A型魏氏梭菌滤液处理，并作梯度稀释，用0.75% 的鸡红细胞滴定，测定M41-R的红细胞凝集效价。M41亲本株、不含IBV病毒的SPF尿囊液、PBS分别作为对照。

3 结果

（1）基因组分段扩增琼脂糖凝胶电泳结果表明成功扩增出了大小为1k～2.6k的目的片段。

（2）1/4片段连接结果如图1，结果表明成功得到了大小为6.84K、6.87K、6.86K、6.95K的目的片段。传拯救。冠状病毒的基因组大，用大容量的载体来搭载其全长cDNA，操作难度大、稳定性差。为了避免以上问题，本研究采用了分段克隆、体外连接全长cDNA、体外转录、细胞转染、鸡胚增殖的技术路线。将全基因组分为较小片段分段克隆的策略进行研究，分段数为14个，每个片段大小在2k左右。3kb以内的外源片段长度是T载体克隆的最适长度，该设计就可以使用常规的pMD19-T载体就可成功克隆所有片段，且重组质粒的稳定性高。

图1 1/4片段连接结果M为1kb DNA Marker；1-4泳道为1/4片段

本研究通过采用将全基因组分为较小片段进行体外扩增具有保真性高，能够在常规克隆载体中稳定复制的优点，利用No See’m技术体外连接获得全长，成功获得了IBV M41株的全长cDNA，通过体外转录获得具有感染性的全长RNA将体外转录物转染BHK-21细胞，接种鸡胚增殖，成功完成了IBV M41株的拯救，获得反向遗传拯救株M41-R。本研究建立了IBV M41这一经典强毒株的反向遗传，完善了IBV的反向遗传研究，为研究强毒株致病机理，毒力基因的研究，以及强毒株减弱后疫苗的研发等提供一个参考。

（3）全长结果

图2 全长连接结果

M为λ -Hind III digest DNA Marker；1：全长IBV M41 cDNA连接产物

（4）EID50测定结果

接种了反向遗传拯救株IBVM41-R的SPF鸡胚能够表现出感染IBV的典型症状。按Reed-Muench法计算，M41-R株的EID50为EID50=107.50/0.2ml。与亲本毒株一致。

（5）HA结果

经A型魏氏梭菌滤液处理的IBV M41-R毒株尿囊液的鸡红细胞凝集价为211，与亲本毒株IBV M41一致。

4 分析与讨论

IBV的基因组不分节段，整个复制周期中无DNA中间体的阶段。因此，IBV的反向遗传研究，必须通过构建基因组的全长cDNA、转录获得感染性的全长基因组RNA以实现病毒的反向遗

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国家自然科学基金“禽冠状病毒（IBV）H120、M41、SAIBk株反向遗传操作和毒力相关基因研究”（30972201）、现代农业产业技术体系建设专项资金（CARS-41-K09）、四川蛋鸡产业链项目（2011NZ0073）

李然，硕士，从事微生物分子生物学研究。

王红宁，女，教授，博士生导师，从事动物疾病防控、微生物基因工程研究。