杨显超王 建葛菲菲徐 锋沈莉萍刘永杰刘佩红

(1.上海市动物疫病预防控制中心,上海 201103；2.南京农业大学动物医学院,江苏南京 201195)

副猪嗜血杆菌菌体蛋白双向电泳技术的建立

杨显超1王 建1葛菲菲1徐 锋1沈莉萍1刘永杰2刘佩红1

(1.上海市动物疫病预防控制中心,上海 201103；2.南京农业大学动物医学院,江苏南京 201195)

目的：建立副猪嗜血杆菌全菌蛋白二维双向电泳技术，获得分辨度高、重复性好的双向电泳图。方法：利用适当的裂解液处理副猪嗜血杆菌，提取菌体蛋白；利用pH梯度等电聚焦对菌体蛋白进行二维电泳；然后采用考马斯亮蓝染色，得到的电泳图谱用Image Master 2D Elite 5.0 图像分析软件进行分析，得出的数据用SPSS15.0 进行统计分析。结果：得到了（1 081±16）个蛋白斑点，蛋白主要集中在pI 4.24～7.20 之间，重复胶的匹配点数为（1057±28），匹配率为97.85%。结论：建立了副猪嗜血杆菌的全菌双向电泳分析方法，2-DE 图谱中蛋白位点的分辨率和重复性非常高，获得了较为理想、清晰的双向电泳图谱，为进一步研究其蛋白质组学奠定了基础。

副猪嗜血杆菌 双向电泳 蛋白质组学

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，HPS）隶属于巴氏杆菌科嗜血杆菌属，是猪上呼吸道的一种共栖菌，在特定条件下可引发猪严重的全身性疾病，主要引起猪纤维素浆膜炎、关节炎和脑膜炎等。该菌较多的与诸如猪蓝耳病、猪圆环病毒2型、猪瘟等混合感染，严重危害了青年猪和仔猪的健康。

近年来，由于该病频发，给养猪业造成严重的经济损失，因此，备受业界专业技术人员等的关注。过去，人们在副猪嗜血杆菌的分子生物学、毒力、致病机理与致病性等方面的研究中取得一些成绩，但是对副猪嗜血杆菌的致病机理模糊不清。即一些研究者在如何确定和描述可能的毒力因素等方面裹足不前。本课题采用双向电泳技术，构建起副猪嗜血杆菌全菌蛋白分离技术。以期为了解副猪嗜血杆菌其主要蛋白表达的变化，差异性表达蛋白的筛选及功能研究奠定基础[1]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

血清型为5型HPS上海分离株SH08-54P为上海市动物疫病预防控制中心细菌室保存。

1.1.2 主要试剂和主要仪器

实验中所提及的材料按照文献[2]所提示的步骤来配置和购买。

主要试剂：脑心浸液（BHI）培养基，哥伦比亚培养基，分别购自北京陆桥公司与OXOID公司。尿素、DTT、低熔点琼脂糖、NAD、Tris碱、硫脲、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、丙烯酰胺、TEMED为Promege公司产品，CHAPS、SDS从Amresco公司购买，ImmobilineTM pH3-10、pH4-7 IPG预制胶条均为美国GE公司产品。蛋白定量试剂盒、考马斯亮蓝（R-350）均购自AMERSHAM公司。PBS、无水乙醇、异丁醇、乙酸、溴酚蓝、甘油、TCA、丙酮为国产分析纯。

主要仪器：ImageScanner扫描仪、ImageMaster 2D Platinum 6.01图像分析软件来自Amersham Biosciences公司；IPGphor、分光光度仪为Hitachi公司；电泳仪（SE-600全套电泳设备）来自Amersham公司；纯水装置为Millpore公司；光密度扫描仪（GS-710）为Bio-Rad公司；冷却水循环系统为Cole-Parmer公司；超声细胞破碎仪为国产。

1.2 方法

1.2.1 菌株的培养

据Elena[3]和Hill[4]等的报道，因为猪只发病时体温一般会有所升高，我们选择了高温等四种条件来模拟该菌在猪体内的生长环境。我们采取模拟体内发病时的体外生长环境：首先，挑取在巧克力培养基上单个生长良好的菌落接种到含200 ml脑心浸液培养基中，其中，一瓶在正常条件下培养，另一瓶在特殊条件下培养。特殊条件为首先往培养基中添加200mM，2-2’-联吡啶和醋酸钠；其次，把培养基放在40℃高温条件下和微需氧条件下培养。

1.2.2 提取菌体蛋白

把两瓶副猪嗜血杆菌培养到对数生长期，然后在4℃，6 000 r/min离心10 min，接下来用预冷PBS清洗3次，最后收集菌体。取0.2 g菌体按照1：4 的比例放入配制好的裂解缓冲液中匀浆；室温静置30 min，4℃ 15 000 r/min 离心60 min，最后用超声仪对其进行超声，最后，上清即为粗提的菌体蛋白。用2-D clean-up kit纯化粗提的菌体蛋白，方法按2-D clean-up kit 试剂盒操作指南进行。我们利用Bradford法蛋白定量试剂盒测定蛋白质的浓度，根据试验需要的蛋白量即1mg/管用1.5mlEP管分装，在-80℃冰箱保存备用。

1.2.3 二维双向凝胶电泳

主要按照Gorg 等[3]方法和Bio-Rad 仪器操作手册进行。

第一相等电聚焦（IEF）：上样量总体积为0.25ml（其中，含有总蛋白质为100 ug）。电压30 V重泡胀12 h后进行等电聚焦，依次经过500 V 1 h、1 000 V 1h、8 000 V 3 h、10 000 V 至总电压积为80 000 Vh。等电聚焦结束后取出IPG胶条，放于平衡液1（6 mmol/L 尿素，2% SDS，pH 8.8 50 mmol/L Tris-HCl，30%甘油，0.2% DTT）和平衡液2（6mmol/L尿素，2%SDS，50 mmol/L Tris-HCl pH8.8，30%甘油，3%碘乙酰胺，溴酚蓝）中各平衡15min。第二相垂直板SDS-PAGE 电泳，步骤为将平衡好的胶条转入垂直电泳槽中进行第二相电泳，聚丙烯酰胺凝胶浓度为12.5%；电泳条件为每胶12mA电泳30min，然后每胶20 mA恒流，直至溴酚蓝指示线到达凝胶底部为止。

1.2.4 考蓝染色

参考Amersham Biosciences实验手册和BIO-RAD双向电泳实验流程方案进行。用10mg的考蓝溶解于95%乙醇中，与10ml 85%磷酸混合，定容到100 ml可于4℃保存数周，试验前用滤纸过滤。染色液200ml 4～6h脱色液200 ml 2～3 h低甲醇脱色液200 ml 4～6 h或过夜保存于室温蒸馏水中。

1.2.5 胶块扫描及图谱分析

利用Image Scanner Ⅱ型透射扫描仪及LabScan 扫描软件对凝胶进行图像扫描。得到的双向电泳图通过ImageMaster 2D Elite 5.0图像分析软件进行分析，得到的数据在SPSS15.0软件上统计分析。

2 结果

2.1 利用pH3-10的胶条进行电泳的试验结果

提取副猪嗜血杆菌的菌体蛋白，首先，使用13 cm pH3～10 IPG胶条观察情况。

图1

图2

2.2 利用pH4-7的IPG干胶条进行双向电泳的试验结果

首先，采用裂解液裂解副猪嗜血杆菌菌体，然后提取该菌的菌体蛋白，为了让试验结果具有很好的可重复性，在相同条件下，对总蛋白同时进行3次双向电泳分离，染色后得到正常培养条件下和经过诱导条件下培养的副猪嗜血杆菌双向电泳图谱3张（图2，图3）。利用Image Master 6.0图像软件分析副猪嗜血杆菌的双向电泳蛋白图谱，同时利用软件对蛋白质电泳图谱进行斑点检测和匹配，并结合人工校正分析，得到以下结果：

（1）用线性范围pH4～7 IPG干胶条进行双向电泳分离蛋白，凝胶染色后进行图像扫描分析，如图2、3所示，我们检测到2000个左右的蛋白点。这些蛋白点都位于pH4～7范围内。这些图谱非常类似，从这可以说明这是重复性很好的方法。所获得的图都非常清晰，蛋白样品得到了较好的分离，并且都没有明显的拖尾现象，图谱中各个部位的点都呈相似的规律分布，可同时满足蛋白点检测和差异比较分析的要求。

（2）对正常培养条件下与诱导培养条件下的副猪嗜血杆菌蛋白质表达图谱匹配后发现：两组图谱中有43个蛋白质点的表达存在明显差异（即蛋白质差异表达量在1.5倍以上），其中15个蛋白差异表达量在3倍以上，6个蛋白质差异表达量完全不同。

图2 正常副猪嗜血杆菌双向凝胶电泳结果

图3 模拟致病的副猪嗜血杆菌双向凝胶电泳结果

3 讨论

副猪嗜血杆菌是一种猪上呼吸道的常在菌，在特殊条件下进入猪体内引发严重的疾病，主要临床特征是纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎[5]。目前，该病的致病机理和毒力因素还不是很明确。因此，增强对该菌致病机理的了解，找出该病的毒力因子是非常有意义的。国际上关于这方面的研究有两个著名的试验，都是为了找寻该菌差异表达的基因。一个试验是利用反转录差异显示技术，Hill等[4]研究证实了在高温条件下，有7个基因表达发生了变异。另外一个试验是运用基因芯片技术，Melnikow等[2]探索在高温，缺氧，缺铁和酸性条件下，有75个基因表达发生了变异。另外，金卉[6]运用转录序列选择性捕获技术，鉴定出该菌在感染猪肺组织中，在体外缺铁和高温条件下，113个基因表达发生变化。继而对其中部分基因编码的蛋白质的免疫原性和与宿主脑组织的相互作用进行了研究。以上这些研究都是为了研究该菌在体外条件下，模拟体内环境基因表达的差异。这些试验结果带给我们很多有待研究的信息。因而，在本课题中，我们把注意力集中到该菌在体外模拟发病猪体内条件来获取差异表达的基因。

猪只在感染该杆菌时，一般会出现发烧，缺铁等临床症状，并且高温条件已经被证实了是重要的影响因子，是关于众多微生物生长的许多外部因素的。环境温度的改变会影响细菌的生长，所以，病原菌得以繁衍的一个最基本的条件是高温条件。另外，铁元素被证实是几乎所有生物体所必须，在3种能量的代谢过程中起到了举足轻重的作用。然而，机体内含有转铁蛋白，游离的铁离子是不能够支撑细菌在机体中的生长[7]。所以，对于病原体来说，机体没有可用游离的铁离子，影响其生长。因而，本研究采用高温和铁两种条件来模拟体内发病情况。

二维双向电泳的样品准备过程是非常有用的，最好的情况是获得无杂质、高纯度和无污染的蛋白。样品制备环节包括蛋白质的提取和处理。所以，本文采用的裂解液中含有能提高蛋白质的溶解度的硫脲和DTT。裂解液中应当添加去垢剂CHAPS，就是为了确保样品能尽可能的溶解和防止蛋白质聚在一起的现象。因为蛋白样品中存在核酸，就可能会堵塞胶块的孔径，使得蛋白聚集在酸性一端，继而会影响图谱。为了尽可能地破除细菌的核酸，我们在裂解细菌时，应配合使用超声。

为了初步了解我们的蛋白样品，我们首先利用线性梯度pH3～10的胶条，观察出蛋白的等电点。因此，本实验预实验用线性梯度pH3～10的胶条先进行实验，知晓样品蛋白的pH范围，通过图1我们可以观察出样品的pH范围在酸性端之间。继而本课题用pH4～7线性梯度的胶条进行正式实验，构建出了高质量的图谱，为了试验能检测到低丰度蛋白质，并准确鉴定蛋白质，我们的二维电泳图谱上的单个蛋白质分离率达到90%以上。

样品的上样量是本实验中另外一个比较重要的因素，直接决定了结果的成功与否。电泳结果图谱上蛋白点表现不足说明上样量太低，最后得到的蛋白质组学的信息量受到影响。反之上样量太高，很可能有部分蛋白在聚焦的过程中在胶条槽中沉淀，并且还有可能堵塞胶孔，使第一向聚焦受到影响。不同物种的样品、胶条的pH值、染色方法、胶条长度等因素影响着上样量的多少。另外，影响等电聚焦的电压是蛋白样品中盐类分子浓度使蛋白质分子不能准确的聚焦，导致图谱上出现横纹和拖尾现象。本试验采用的2D Clean- Up Kit试剂盒，有两方面优点：一方面，可以去除蛋白样品中的盐分、脂类、糖类等非蛋白成分，另外一方面，也可以避免蛋白丢失。最后，为了更加有效地除去盐类对等电聚焦的影响，在设置等电聚焦程序时可以延长了低电压时间。

本课题对细菌裂解液配方、样品处理方法、上样量大小和胶条选择等几个方面的试验进行优化，构建起一套适合副猪嗜血杆菌蛋白质组分析的双向电泳技术，即以裂解液配合超声裂解细菌来提取样品，接下来用100μg蛋白上样，并结合适宜的电泳IEF参数，选用适合的胶条，获得了高分辨率的电泳图谱，为后续鉴定蛋白提供很好的基础。

[1] Zou Q，Yan X，Li B，et al. Proteome analysis of sorbitol fermentation specific protein in Vibrio cholerae by 2-DE and MS [J] . Proteomics，2006，6（6）：1848- 1855.

[2] 张爱玲.2型猪链球菌强毒株与无毒株胞外蛋白的比较蛋白质组研究[D].吉林大学，2007.

[3] Elena Melnikow，Saffron Dornan，Carole Sargent，et al. Microarray analysis of Haemophilus parasuis gene expression under in vitro growth conditions mimicking the in vivo environment[J]. Veterinary Microbiology，2005，（110）：255-263.

[4] Hill C E，Metcalf D S，Maclnnes J I. A search for viruLence genes of hamophilus parasuis using differential display RT-PCR[J]. Vet Mic，2003，96（2）：189-202.

[5] Little T.W.A.. Haemophilus parasuis infection in pigs[J]. Veterinary Record，1970，（87）：399-402.

[6] 金卉.副猪嗜血杆菌感染和应激相关基因的鉴定与功能研究[D].华中农业大学，2009

[7] Westbrook JA，Yan JX，Wait R，et al. Zooming in on the proteome：very narrow-range immobilized pH gradients reveal more protein species and isoforms. Electrophoresis，2001，（22）：2865-2871.

沪农科攻字（2014）第7-3-3号

杨显超（1985-），男，江西九江人，硕士研究生，主要从事动物传染病学研究。