佘一凡，武　青，张春雷，房兴堂，何丹丹，陈　宏(江苏师范大学 细胞与分子生物学研究所 生命科学学院，江苏 徐州 221116)



科学研究

中国黄牛mtDNA 16S rRNA基因遗传多样性与系统进化分析

佘一凡，武青，张春雷，房兴堂，何丹丹，陈宏*(江苏师范大学 细胞与分子生物学研究所 生命科学学院，江苏 徐州 221116)

[摘要]采用 PCR和 DNA 测序技术和生物信息学方法，测定分析了10个中国黄牛品种(群体)和2个外来牛品种共131个体的mtDNA 16S rRNA基因全序列的遗传变异，并分析了品种(群体)间的亲缘关系以及母系起源。结果表明，在12个群体131条16S rRNA基因序列中，共发现了78个变异位点，形成了40种单倍型，揭示了中国黄牛群体具有丰富的遗传多样性。总群体的平均单倍型多样性指数(Hd)为0.857±0.024，平均核苷酸多样性指数(Pi)为0.00582，Kimura双参数品种间遗传距离范围为0.001～0.009，10个中国黄牛品种(群体)核苷酸多样度高于2个外来牛品种。基于Kimura-2-parameter距离采用NJ法构建了10个中国黄牛品种(群体)分子系统树，111个体聚为2簇，即分别与瘤牛和普通牛聚在一起，说明中国黄牛存在两个母系起源，主要起源于瘤牛和普通牛。其中草原红牛和蒙古牛起源于普通牛，恩施牛主要起源于瘤牛，但是对于亲缘关系复杂的中原地区黄牛而言，瘤牛和普通牛对它们的影响力大小因品种而异。这些结果为我国黄牛的种质资源保护、杂交育种和品种改良奠定了分子遗传学基础。

[关键词]中国黄牛；mtDNA 16S rRNA；遗传多样性

我国地方黄牛种质资源十分丰富，但是近年来由于对地方良种的品种特性认识不够以及受外来肉用和乳用性能高的品种的杂交冲击等原因[1]，我国地方良种黄牛品种资源数量和质量都有不同程度的下降，保种工作面临着巨大的挑战。种质资源的保存和利用的原动力则是品种间和品种内的遗传变异，即基因的多样性和多态性，只有充分了解我国地方黄牛种间和种内的亲缘关系、起源进化和遗传多样性才能对其进行更好的保护和利用[2]。

线粒体 DNA 在哺乳动物作为唯一的核外遗传物质具有结构简单、重组率小、进化速度快、母系遗传等特点[3]，目前成为研究动物母系起源进化、系统发育、亲缘关系、基因流动的重要标记[4]，且大多集中在变异率大的mtDNA D-loop区[5-6]和 Cyt b[7-8]基因，以此揭示了动物的起源进化和品种间的亲缘关系。Khan和吴夏等的研究表明，线粒体DNA 16S rRNA基因在生物中普遍存在，其功能相同，可变序列与进化距离相一致，可以准确反映生物之间的进化关系，是一个理想的遗传标记，被誉为“分子钟”[9]。16S rRNA基因现已广泛用于鱼类和昆虫类的亲缘关系和系统进化研究[10-13]。但关于中国黄牛mtDNA 16S rRNA基因多态性及其对中国黄牛系统进化的研究尚未见报道。因此，本研究通过对12个中外黄牛群体mtDNA 16S rRNA基因序列的比对，揭示了中国黄牛的遗传多样性及其类群间的亲缘关系，为我国黄牛起源进化、种质资源保护、杂交育种和品种改良选育提供科学依据。

1材料与方法

1.1试验动物和血样的采集

本研究所采集的是12个黄牛品种(群体)的131不同个体，其中中国黄牛有10个品种(群体)，包括6个地方黄牛品种秦川牛、南阳牛、郏县红牛、恩施牛、早胜牛、蒙古牛和3个培育品种夏南牛(法国夏洛莱牛X南阳牛)、中国荷斯坦牛(荷兰荷斯坦牛X中国黄牛)和草原红牛，1个正在培育的徳南牛(德国黄牛X南阳牛)，2个外来牛品种是安格斯牛和日本和牛；采集方法是进行颈静脉采血，每头牛采集10 mL血样，常温运输带回实验室，并置于-20 ℃冷冻冰箱保存。12个牛品种(群体)样本数以及品种英文名称简写见表 1。

表1　12个黄牛类群mtDNA 16S rRNA序列多态性位点

1.2基因组的DNA提取及检测

采用常规酚-氯仿法进行牛血样全基因组DNA的提取，用1%的琼脂糖凝胶电泳以及Nanodrop 2000双重检测提取DNA的浓度和纯度，并将产物置于-20 ℃冰箱保存备用。

1.3mtDNA 16S rRNA基因引物设计

在GenBank中查找普通牛完整线粒体基因组序列(AY526085)，根据基因的核苷酸序列设计一对引物。16S rRNA-F: GCATCCAGTTTACACCTAGA，16S rRNA-R:GCTCTGCCACCTTAACTA。扩增片段的长度约为1 729 bp。

1.4mtDNA 16S rRNA基因扩增与测序

PCR反应体系总体积为30 μL，含1.2 μL (50 ng/μL)的基因组DNA 作为模板，15 μL 2×Reaction Mix，11.16 μL ddH2O，1.2 μL (10 pmol/μL)16S rRNA-F，1.2 μL (10 pmol/μL)16S rRNA-R，0.24 μL(2.5 U/μL) Golden DNA 聚合酶。PCR反应程序94 ℃预变性3 min，9 4 ℃变性45 s，57 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，共35个循环，72 ℃延伸10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测后送至上海生工生物工程公司进行正、反双向测序。

1.5数据处理

首先根据测序峰图用DNAMAN 7.0对序列进行拼接编辑。利用ClusalX 2.0软件进行序列转换比对，并辅以人工校对。其次使用Mega 5.0计算mtDNA 16S rRNA基因序列碱基组成、变异位点以及碱基转换、颠换值；基于Kimura-2-Parameter模型计算类群间的遗传距离，采用NJ法构建系统进化树，且系统发育树各分支的置信度( bootstrap) 均进行1000次重复检验。接着运用Dnasp 5.0分析黄牛12个类群的单倍型多样性Hd、核苷酸多样性Pi，并进行Tajima' s D中性检验。采用NETWORK 4.6.1.3 软件绘制单倍型间的进化网络图[14]。

2结果与分析

2.1黄牛类群mtDNA 16S rRNA基因的核苷酸组成

通过整理去除测序结果的两端多余序列，得到12个黄牛类群mtDNA 16S rRNA基因全序列，长度为1 570 bp，碱基排列相对保守，胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)四种核苷酸的平均比例分别是23.7%(23.5%～23.9%)、20.9%(20.6%～21.0%)、37.8%(37.4%～38.0%)、17.6%(17.5%～18.0%)，A+T平均含量为61.6%(60.9%～61.9%)显著高于C+G平均含量38.4%(38.1%～39.0%)。核苷酸组成表现出明显的碱基偏倚性。核苷酸组成上中国地方黄牛与杂交培育品种、外国牛品种没有明显差异。

2.2黄牛类群mtDNA 16S rRNA基因的核苷酸多样性

在131个个体中共发现78个突变位点，约占全长的4.94%，其中单一多态位点38个，简约信息位点40个(见表1)，其中能稳定区分与标准序列不同的位点有13个。从12个黄牛类群内分析，荷斯坦牛多态位点最多为37个，其中有10个单态变异位点，荷斯坦牛较其他类群多态性更为丰富。10个国内品种变异位点高于2个外来品种。序列变异中存在转换、颠换两种核苷酸变异类型，未发现碱基的缺失或插入。在所有的核苷酸突变中，转换的发生频率占62.3%，颠换的发生频率仅占37.8%。其中腺嘌呤(A)与鸟嘌呤(G)之间的转换占总转换数的37.4%，胞嘧啶(C)与胸腺嘧啶(T)之间的转换占24.9%，总体转换/颠换偏倚R值为1.65。据研究发现，通常亲缘关系较近的分类阶元之间核苷酸替换主要为转换，而在亲缘关系较远的分类阶元之间，核苷酸替换率则以颠换为主[15-16]。本研究发现黄牛mtDNA 16S rRNA基因核苷酸突变位点的变异类型以转换为主，验证了上述规律。

2.312个黄牛类群基于mtDNA 16S rRNA基因的单倍型系统进化分析

从已获得的131条16S rRNA基因全长序列中定义了40种单倍型：Hap1～Hap40(见表2)。其中单倍型频率较多的是Hap4和Hap2，Hap4在所有种群中出现38次，占所有种群的29.4%；Hap2次之，占23.3%。图1是基于mtDNA 16S rRNA基因40种单倍型聚类网络图，从图1可以看出12个黄牛类群40种单倍型被划分为两个聚类簇，表明本研究中黄牛存在两个母系起源，其中Hap4和Hap2在网络的中心位置，群体中出现频率最高，Hap6、Hap22、Hap28单倍型频率高于其他单倍型。图1中Hap23偏离中心位置，表明该单倍型较为特殊。

表2　12个类群黄牛mtDNA 16S rRNA基因的单倍型分布

图1　不同黄牛类群16S rRNA单倍型聚类网络图

2.4中国黄牛mtDNA 16S rRNA基因的遗传多样性分析

12个黄牛类群mtDNA 16S rRNA基因单倍型、核苷酸多样性分析及Tajima's D中性检验结果如表3所示。由表3可知，12个类群的总体平均单倍型多样性指数Hd为0.857±0.024，平均核苷酸多样性指数Pi为0.00582。单倍型的多样性变化范围在0.786～0.977之间，种群内核苷酸多样性变化范围在0.00367～0.01024之间，其中荷斯坦牛核苷酸多样性最高且单倍型多样性较高，日本和牛核苷酸多样性最低且单倍型多样性最低，说明其遗传变异最小，即该品种的遗传一致性最高。10个中国黄牛品种(群体)核苷酸多样度高于2个外来牛品种(除恩施牛和草原红牛)，这说明中国黄牛品种的遗传变异较大，具有丰富的遗传多样性。

对黄牛12个类群mtDNA 16S rRNA基因全序列基于Tajima's D值进行中性检验(表3)，检测结果总群体D值为-1.41198，差异不显著(P>0.10)，说明本研究黄牛类群在进化过程基本遵循中性进化模型，群体大小保持相对稳定。

2.5中国黄牛类群间的遗传距离及其起源进化分析

遗传距离最早是用来估计不同群体之间遗传分化程度的指标[17]，中国黄牛12个类群间Kimura-2-Parameter遗传距离范围为0.001～0.010，由表4可以看出，草原红牛与日本和牛遗传距离最小为0.001，并且分别与恩施牛、徳南牛遗传距离最大。

由图2可以看出，早胜牛和蒙古牛首先聚在一起，然后与草原红牛、日本和牛聚为一类，再与荷斯坦牛和秦川牛聚在一起，最后与郏县牛和安格斯牛聚成一个大类；另外一大类是由亲缘关系相对较远的恩施牛与徳南牛、夏南牛与南阳牛聚成。

表4　黄牛12个类群16S rRNA序列遗传距离

Note:The figures in the table are expanded 100 times

图2　12个黄牛品种的UPGMA聚类图

3讨论

3.1中国黄牛类群的遗传多样性

从试验结果得到中国黄牛16S rRNA基因序列A+T平均含量为61.6%显著高于C+G平均含量38.4%，核苷酸组成表现出明显的A、T碱基偏倚性。在黄牛的线粒体基因组中，张桂香等[18]测得黄牛D-loop区，A+T平均含量为61.7%。蔡欣等[20]测得Cyt b基因序列富含碱基A和T，A+T平均含量为56.2%。综上，16S rRNA和D-loop区为非蛋白编码序列，A+T含量大于Cyt b基因蛋白质编码序列，表明非编码序列比编码序列具有更高的A、T碱基偏倚性。研究认为牛亚科线粒体基因的碱基偏倚性及其密码子的使用情况和线粒体基因序列一样，均可以用于物种的亲缘关系研究[19]。本研究中共发现了78个突变位点，约占全长的4.94%。彭华[6]研究发现D-loop区突变率为11%，ND5 基因约为2%，因此D-loop和16S rRNA基因是用来分析品种间系统发育最有效的工具。

通常认为，群体中的单倍型多样性(Hd)和核苷酸多样性(Pi)是衡量一个群体线粒体DNA变异程度的两个重要指标，其值与群体遗传多样性呈正相关。本研究平均单倍型多样性和核苷酸多样性指数低于Cyt b基因研究结果[20](Hd=0.783±0.046 Pi=0.0828)，同时也低于王朝峰[21]所测中国黄牛mtDNA D-loop。证明中国黄牛mtDNA 16S rRNA基因序列进化稳定，同时也具有丰富的遗传多样性。对比武志娟[22]研究西藏牦牛类群16S rRNA基因序列发现，中国黄牛核苷酸多样性和单倍型多样性高于西藏牦牛(Hd=0.850±0.0009 Pi=0.0291 )，这与中国黄牛地理分布广、种群庞大和起源复杂有着密切的关系。

中国黄牛在16S rRNA基因总体上较外来牛种相比具有相对丰富的多态性，而且各个品种内也显示出丰富程度不同的核苷酸多样性。12个黄牛品种两两之间表现出的遗传距离可能与不同品种的地理分布具有一定的关系，草原红牛、荷斯坦牛和日本和牛分别与恩施牛、德南牛品种间的遗传距离较大而他们彼此间的距离相对较低，这种差异可能是由地理隔离导致北方黄牛和南方黄牛之间不易发生基因交流从而具有一定的群体遗传分化，此观点与常洪等[23]的研究结果基本吻合。

3.2中国黄牛mtDNA 16S rRNA基因系统进化关系

中国黄牛的起源进化一直是中外学者最感兴趣的研究课题之一，但中国黄牛起源复杂。邱怀等[24]将同种异名的黄牛归并后，确定我国尚有28个地方固有黄牛品种；同时把中国黄牛按地理分布区域，分为北方黄牛、中原黄牛和南方黄牛三大类。陈宏等[25]通过对黄牛Y染色体多态性进行分析，发现北方黄牛受普通牛的影响大,南方黄牛受瘤牛的影响大，中原黄牛同时受普通牛和瘤牛的影响。本研究以mtDNA 16S rRNA为标记，选择我国10个黄牛品种进行系统进化分析，定义了40种单倍型，构成2个主要单倍型组并从单倍型网络关系图上看出分为2个聚类簇，说明中国黄牛存在2个母系来源。根据遗传距离构建了NJ系统进化树，表明草原红牛和蒙古牛起源于普通牛属于北方牛种，恩施牛和徳南牛主要起源于瘤牛，原因是由于分布于长江以南地区，地理位置较为接近，遗传距离近，瘤牛的特征非常明显，属于南方牛种。其他牛种同时含有普通牛和瘤牛血统，但是不同品种受普通牛和瘤牛的影响程度有所差别。其中南阳牛和夏南牛受瘤牛影响较大，荷斯坦牛和早胜牛主要受普通牛影响较大。这与彭华[6]基于D-loop区分析我国地方黄牛品种间的相互关系及其起源进化结果一致。秦川牛、郏县牛、属于中原牛种，受普通牛和瘤牛的影响均等。这在分子水平上印证了陈宏等[25]的结果。并与陈幼春从头颅骨分类、毛色、血液蛋白多态性、体型体态研究中国黄牛起源结果一致。

本研究利用mtDNA 16S rRNA基因对我国10个黄牛品种进行序列分析，揭示了中国黄牛具有丰富的遗传多样性据此可以制定种质资源保护计划和方案；同时通过黄牛品种间亲缘关系的远近还可以预测不同品种在杂交改良中的利用效果；只有在对地方品种进行保护的基础上采取适当的杂交改良，才能使现存的优良资源得到可持续发展。

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Genetic Diversity and Phylogenetic Analysis of mtDNA 16S rRNA

Gene of Chinese Yellow Cattle Breeds

SHE Yi-Fan, WU Qing , ZHANG Chun-Lei, FANG Xing-Tang, HE Dan-dan, CHEN Hong*

(InstituteofCellularandMolecularBiology,SchoolofLifeScience,JiangsuNormalUniversity,XuzhouJiangsu,221116,China)

Abstract:Through PCR and DNA sequencing and bioinformatics methods, genetic variation of the full sequence of the mtDNA 16S rRNA gene, the genetic relationships and maternal origins were studied on the research of 131 samples, including ten breeds of Chinese cattle and two foreign breeds. Among the 131 genetic sequences of these twelve breeds, 78 variable sites were detected and they formed 40 kinds of haplotypes, which indicates the genetic diversity of Chinese cattle. Among the breeds, the average haplotype diversity index was 0.857±0.024. The average nucleotide diversity index was 0.00582 and the genetic distance between Kimura two-parameter breeds was 0.001～0.009.The nucleotide diversity of the ten breeds of Chinese cattle is higher than the two foreign breeds. The neighbor-joining phylogenetic tree of the Chinese yellow cattle based on the Kimura-2-parameter distance indicated that the 111 individuals were grouped into two clades, which suggests that the Chinese cattle have two maternal origins, mainly from Bos taurus and Bos indicus. The Grassland red cattle and the Mongolia beef originate from Bos taurus and Enshi cattle mainly originates from Bos indicus. These results lay the foundation of molecular genetics for Chinese yellow cattle's development, utilization of hybrid vigor and cultivation of new beef cattle.

Key words:Chinese yellow cattle breeds; 16S rRNA; genetic diversity

[文章编号]1005-5228(2015)12-0012-07

[中图分类号]S811.5

[文献标识码]A

*[通讯作者]陈宏(1955-)，男，陕西西安人，教授，博士生导师。研究方向：分子遗传学与家畜育种。E-mail：chenhong1212@263.net

[作者简介]佘一凡(1991-)，女，江苏南通人，硕士研究生，研究方向：动物分子生态与系统进化。E-mail：892281967@qq.com

[基金项目]现代农业(肉牛)产业技术体系专项(cars-38)；陕西省科技统筹创新工程计划项目(2014kTZB02-02-02-02，2015kTcL02-08)；国家发改委生物育种能力建设与产业化专项(2014-2573)。

*[收稿日期]2015-10-07修回日期：2015-11-13