陈小霞，谢 娟，黄 成，孟晓明，李 俊

（安徽医科大学药学院，安徽医科大学肝病研究所，安徽省高校产业共性技术研究院，安徽合肥 230032）

EZH2对HSC-T6细胞增殖活化的影响及其部分机制研究

陈小霞，谢 娟，黄 成，孟晓明，李 俊

（安徽医科大学药学院，安徽医科大学肝病研究所，安徽省高校产业共性技术研究院，安徽合肥 230032）

中国图书分类号：R-332；R322.47；R329.24；R341；R575.202.2

摘要：目的 探讨Zeste基因增强子同源物2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）表达沉默对大鼠肝星状细胞HSC-T6细胞增殖活化的影响，及其部分调控机制。方法 应用EZH2的抑制剂DZNep（3-Deazaneplanocin A）作用于TGF-β1诱导活化的HSC-T6细胞，采用Western blot法检测蛋白EZH2、p-ERK、p-AKT和α-SMA的表达；根据EZH2的碱基序列设计并合成小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA），通过脂质体LipofectamineTM2000转染到HSC-T6细胞内，应用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测HSC-T6细胞的增殖变化，Western blot法检测蛋白EZH2、p-ERK、p-AKT和α-SMA的表达。结果 将DZNep加入TGF-β1诱导活化的HSC-T6细胞后，EZH2蛋白水平明显降低，同时p-ERK、p-AKT和α-SMA蛋白水平亦明显降低；将EZH2-siRNA转染活化的HSC-T6细胞内，HSC-T6细胞的增殖可明显被抑制，同时EZH2、p-ERK、p-AKT和α-SMA蛋白水平亦明显降低。结论 抑制EZH2的表达可明显抑制HSC-T6细胞的增殖活化，EZH2可能是潜在的治疗肝纤维化的靶点。

关键词：组蛋白甲基化；肝星状细胞；Zeste基因增强子同源物2；DZNep；肝纤维化；p-ERK；p-AKT；α平滑肌肌动蛋白

网络出版时间：2015－7－22 10：42 网络出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150727．0901．010．html

肝纤维化是持续性肝脏损伤的共同病理改变过程，主要表现为细胞外基质（extracellular matrix，ECM）在肝脏中的大量沉积，其持续发展可形成肝硬化和肝细胞癌［1］。肝纤维化的形成机制目前尚不清楚，研究表明肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）的增殖活化是肝纤维化形成的关键，抑制HSC的增殖活化成为防治肝纤维化的重点［2］。有文献报道，Zeste基因增强子同源物2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）在纤维化形成中起重要作用［3］。肝纤维化形成过程中，MAPK／ERK和PI3K／AKT通路被激活并起重要作用。研究发现，EZH2能够激活MAPK／ERK和PI3K／AKT通路，从而引起疾病［4］。本研究拟应用EZH2的抑制剂DZNep和小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）抑制EZH2的表达，考察其对HSC增殖活化的调控作用，探究其调控机制，以期为肝纤维化的防治提供新的靶点。

1　材料

1．1细胞株 大鼠肝星状细胞株HSC-T6购于南京凯基生物科技发展有限公司。

1．2试剂与仪器 DZNep购于Selleckchem公司；TGF-β1购于Peprotech公司；噻唑蓝MTT购于Sig-ma公司；DMSO购于Sigma公司；胰蛋白酶、DMEM培养基为Hyclone公司产品；胎牛血清购于杭州四季青公司；山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG购于北京中杉金桥生物技术有限公司；脂质体Lipofectami-neTM2000、Opti-MEM购于Invitrogen公司；EZH2、p-ERK、ERK、p-AKT和AKT抗体购于Cell Signaling公司；α-SMA抗体购于北京博奥森生物技术有限公司；β-actin抗体购于北京中杉金桥生物技术有限公司；倒置荧光显微镜（OLYMPUS公司，日本）；酶标仪（bio-tekEL）。

2　方法

2．1HSC-T6细胞的培养 应用含10%胎牛血清的DMEM培养基，在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下进行细胞培养，待细胞长至70%～80%密度时进行细胞传代。

2．2DZNep的应用 加入DZNep 24 h前，将细胞传代至6孔培养板，每孔2×105细胞。实验分正常组、应用TGF-β1刺激的模型组、TGF-β1刺激并加入DZNep的恢复组。正常组不做任何处理；模型组加入TGF-β1刺激终浓度为10 μg·L－1，TGF-β1作用于细胞的时间为48 h；恢复组加入TGF-β1刺激终浓度为10 μg·L－1，并加入DZNep刺激终浓度为1 μmol·L－1，DZNep作用于细胞的时间为24 h。

2．3siRNA的合成 根据siRNA设计原则，设计针对EZH2基因的siRNA序列，在GenBank表达序列标签（EST）数据库应用BLAST检索，并确认所设计siRNA序列的唯一性，靶向目的基因EZH2的序列设计的两条链，正义链：5′-GGGCAUCUUUAU-CAAAGAUTT-3′；反义链：5′-AUCUUUGAUAAAGAU GCCCTT-3′。同样方法构建阴性对照组的两条链，正义链：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′；反义链：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′，与任何编码序列无同源性，由吉玛制药有限公司合成有效siRNA干粉制剂。

细胞培养及siRNA转染HSC-T6细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基，37℃、5%CO2培养。转染24 h前，传代至6孔培养板，每孔2×105细胞。实验分正常组、模型组、阴性对照组和EZH2-siRNA实验组。正常组不做任何处理；模型组加入TGF-β1；阴性对照组转染FAM标记的阴性对照siR-NA并加入TGF-β1；实验组转染EZH2-siRNA并加入TGF-β1。用Opti-MEM和脂质体作为转染试剂进行转染，使siRNA终浓度均为100 pmol·L－1，置于37℃、5%CO2培养箱转染6 h后，每组加入完全培养基含TGF-β1使刺激终浓度为10 μg·L－1，继续培养48 h，收获细胞。采用荧光倒置显微镜观察各组转染后的细胞形态并判断转染效果。

2．4细胞增殖实验 以MTT法检测HSC-T6细胞的增殖，分组同上。将培养的HSC-T6细胞以10%胎牛血清的DMEM制备成1×108·L－1的细胞悬液，接种于96孔板，每孔100 μL，过夜，待细胞贴壁后进行细胞转染，转染后6 h换液，每孔加入完全培养基200 μL含TGF-β1使刺激终浓度为10 μg· L－1，37℃、5%CO2培养箱中继续培养12、24、48、72 h，然后每孔加0.5%MTT贮存液20 μL继续孵育4 h，最后弃上清，每孔加入150 μL二甲基亚砜溶解细胞内结晶，置于恒温震荡器上震摇10 min，应用酶标仪于490 nm波长处测定吸光度值，以空白对照组作为对照组，其细胞存活率为100%，其余各组按：存活率／%＝［（各实验组吸光度值-本底吸光度值）／（对照组吸光度值－本底吸光度值）］×100%。

2．5Western blot检测EZH2、p-ERK、p-AKT、α-SMA蛋白表达 细胞的培养、分组、处理同上。DZNep作用24 h或者转染EZH2-siRNA 48 h后，分别提取细胞总蛋白，应用BCA法测定蛋白浓度。应用10%SDS-PAGE凝胶进行电泳，在200 mA恒定电流下应用PVDF膜进行转膜，TBST洗膜后，使用5%牛奶封闭非特异性结合位点，TBST洗膜后，在4℃于一抗（1∶500）中孵育过夜，TBST洗膜后，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠或抗兔二抗（1∶10 000）室温中孵育1 h，TBST洗膜后，加入ECL发光剂反应20 s，电脑显影成像，实验重复3次或以上。

2．6统计学处理 采用SPSS 13.0软件进行统计分析，数据以±s表示。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。

Fig 1 Protein expression of EZH2（A），p-ERK，p-AKT（B）and α-SMA（C）detected by Western blot after application of DZNep

3　结果

3．1Western blot法检测应用DZNep后HSC-T6细胞中EZH2、p-ERK、p-AKT和α-SMA蛋白表达变化 加入TGF-β1的模型组EZH2蛋白表达水平明显升高，与正常组相比差异有显著性（P＜0.01），加入TGF-β1和DZNep的恢复组EZH2蛋白表达水平明显降低，与模型组相比差异有显著性（P＜0.01），见Fig 1A；同时，模型组p-ERK和p-AKT蛋白表达水平明显升高，与正常组相比差异有显著性（P＜0.01），恢复组p-ERK和p-AKT蛋白表达水平明显降低，与模型组相比差异有显著性（P＜0.01），见Fig 1B；与此同时，模型组α-SMA蛋白表达水平明显升高，与正常组相比差异有显著性（P＜0.01），恢复组α-SMA蛋白表达水平明显降低，与模型组相比差异有显著性（P＜0.01），见Fig 1C。

3．2MTT法检测HSC-T6增殖活性 MTT实验结果显示，EZH2-siRNA瞬时转染对TGF-β1诱导的HSC-T6细胞的增殖有明显的抑制作用，EZH2-siR-NA实验组作用12 h细胞抑制率与阴性对照组、模型组之间差异无显著性（P＞0.05）；EZH2-siRNA实验组作用24、48、72 h细胞抑制率明显高于阴性对照组、模型组（P＜0.05）。同时，作用24、48、72 h时模型组、阴性对照组与正常组之间差异有显著性（P ＜0.05），见Fig 2。

3．3Western blot法检测siRNA转染后HSC-T6细胞中EZH2、p-ERK、p-AKT和α-SMA蛋白表达变化 瞬时转染EZH2-siRNA 48 h后，EZH2蛋白表达明显降低，与阴性对照组相比差异有显著性（P＜0.01），阴性对照组、模型组与正常组相比差异亦有显著性（P＜0.01），见Fig 3A；同时，EZH2-siRNA实验组p-ERK和p-AKT蛋白表达也明显降低，与阴性对照组相比差异有显著性（P＜0.01），阴性对照组、模型组与正常组相比差异亦有显著性（P＜0.01），见Fig 3B；与此同时，EZH2-siRNA实验组α-SMA蛋白表达也明显降低，与阴性对照组相比差异有显著性（P＜0.01），阴性对照组、模型组与正常组相比差异亦有显著性（P＜0.01），见Fig 3C。

Fig 2 Proliferation of HSC cells determined by MTT after transfection with siRNA of EZH2

4　讨论

HSC的增殖活化是肝纤维化发生发展的关键环节，抑制HSC的增殖活化成为预防和治疗肝纤维化的重要手段之一［5］。近些年研究发现［6－9］，表观遗传学（包括DNA甲基化、microRNA和组蛋白修饰等）在肝纤维化的发生发展中扮演重要角色。组蛋白修饰是指在组蛋白相关酶的作用下，组蛋白发生乙酰化、磷酸化、甲基化和泛素化等修饰的过程。组蛋白的甲基化修饰是由组蛋白甲基转移酶来实现的，组蛋白的甲基化可发生在组蛋白的赖氨酸和精氨酸残基上，最终可导致基因的转录沉默或转录激活。研究发现［10］，组蛋白的甲基化修饰与HSC的状态及转归密切相关。EZH2是一个重要的组蛋白甲基转移酶，通过特异性甲基化基因启动子区域组蛋白H3赖氨酸27，广泛参与了基因的转录沉默。在癌症的发生发展中，EZH2被认为是一个促癌基因，在子宫内膜癌、前列腺癌、肝癌等恶性肿瘤中高表达［11－13］。有研究发现，EZH2在肝纤维化形成中扮演重要角色，但是其具体机制尚不清楚。

Fig 3 Protein expression of EZH2（A），p-ERK，p-AKT（B）and α-SMA（C）detected by Western blot after transfection with EZH2 siRNA

有文献报道［14－15］，在生长因子TGF-β1等的刺激下，MAPK／ERK和PI3K／AKT信号通路被激活，进而影响到大鼠肝星状细胞HSC-T6的增殖活化。有研究发现，EZH2能够激活MAPK／ERK和PI3K／AKT信号通路从而引起疾病的发生。那么EZH2能否影响TGF-β1诱导的HSC的增殖活化，EZH2通过何种机制影响其增殖活化，目前尚未见文献报道。在该项研究中，应用TGF-β1诱导HSC增殖活化，同时应用EZH2的抑制剂DZNep和siRNA技术，抑制HSC-T6中EZH2的表达，观察EZH2表达下调后对TGF-β1诱导的HSC增殖活化的影响，及其对MAPK／ERK和PI3K／AKT信号通路的影响。应用EZH2的siRNA后，与阴性对照组比较，EZH2-siRNA实验组EZH2蛋白表达水平明显降低，表明瞬时转染实验成功。MTT法是评估细胞增殖的一种有效方法，MTT的结果表明，通过siRNA沉默EZH2的表达可明显抑制TGF-β1诱导的HSC-T6细胞的增殖。α-SMA是HSC活化的特征性标志，Western blot检测结果显示，应用抑制剂DZNep后，可明显降低α-SMA蛋白的表达；靶向干扰HSC-T6细胞中EZH2的表达，可明显降低α-SMA蛋白的表达。表明抑制EZH2的表达能影响TGF-β1诱导的HSC的增殖活化。结果进一步表明，应用TGF-β1刺激HSC-T6细胞可明显升高EZH2蛋白表达水平，也可明显升高p-ERK、p-AKT蛋白表达水平。应用抑制剂DZNep后可明显降低EZH2蛋白表达水平，也可明显降低p-ERK和p-AKT蛋白表达水平。靶向干扰HSC-T6细胞中EZH2基因的表达，可明显降低EZH2蛋白表达水平，也可降低p-ERK和p-AKT蛋白表达水平。表明抑制EZH2的表达能影响TGF-β1诱导的HSC中MAPK／ERK和PI3K／AKT信号通路的激活。抑制EZH2的表达能影响MAPK／ERK和PI3K／AKT信号通路的激活，是影响TGF-β1诱导的HSC增殖活化的机制。

综上，抑制HSC-T6细胞中EZH2基因的表达，能影响TGF-β1诱导的HSC中MAPK／ERK和PI3K／AKT信号通路的激活，从而抑制HSC的增殖活化。本研究从细胞分子水平阐明EZH2对HSC的增殖活化的调控作用及其可能的潜在调控机制。揭示了EZH2在肝纤维化发展中的重要作用，可能成为防治肝纤维化的潜在新靶点，还需要通过其它实验进一步验证。肝纤维化的形成过程非常复杂，EZH2如何调控基因的沉默，尚需进一步深入研究。

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EZH2 plays a role in HSC-T6 cell proliferation and activation affecting MAPK／ERK and PI3K／AKT pathway

CHEN Xiao-xia，XIE Juan，HUNANG Cheng，MENG Xiao-ming，LI Jun
（School of Pharmacy，Anhui Medical University，Institute of Liver Diseases of Anhui Medical University，Anhui Institute of Innovative Drugs，Hefei 230032，China）

Abstract：Aim To investigate the effects of cell pro-liferation and activation in HSC-T6 cells by inhibiting the expression of EZH2，and its partial relevant mech-anism．Methods By introducing the inhibitor DZNep in activated HSC-T6 cells stimulated by TGF-β1，the protein expression levels of EZH2，p-ERK，p-AKT and α-SMA were detected by Western blot．The siRNA targeting EZH2 was designed and synthesized according to its nucleotide sequence，and their corresponding ex-pression vectors were constructed and transfected into HSC-T6 cells with LipofectamineTM2000．The prolifer-ation of HSC-T6 cells was determined by MTT．And the protein expression levels of EZH2，p-ERK，p-AKT and α-SMA were measured by Western blot．Results By introducing the inhibitor DZNep in activated HSC-T6 cells stimulated by TGF-β1，it effectively de-creased the protein levels of EZH2 and also the protein levels of p-ERK，p-AKT and α-SMA．By introducing EZH2-siRNA in activated HSC-T6 cells，it effectively inhibited the cell proliferation，and also the protein levels of EZH2，p-ERK，p-AKT and α-SMA．Conclu-sion Silencing EZH2 expression inhibits HSC-T6 cell proliferation and activation，and EZH2 may be a poten-tial therapeutic target gene for hepatic fibrosis．

Key words：histone methylation；hepatic stellate cells；enhancer of zeste homolog 2；3-deazaneplanocin A；hepatic fibrosis；p-ERK；p-AKT；alpha-smooth muscle actin

作者简介：陈小霞（1987－），女，硕士，研究方向：抗炎免疫药物的筛选及其作用机制，E-mail：chenxiaoxiahuhongd＠163．com；李 俊（1960－），男，博士，教授，博士生导师，研究方向：临床药理学、抗炎免疫药理学，通讯作者，Tel：0551-65161001，E-mail：lijun＠ahmu．edu．cn

基金项目：国家自然科学基金资助项目（No 81273526）；博士点基金资助项目（No 20123420120001）；安徽省教育厅基金资助项目（No KJ2012A156）；安徽省自然科学基金资助项目（No 1308085MH145）；安徽医科大学基金资助项目（No XJ201118）

收稿日期：2015－03－07，修回日期：2015－04－12

文献标志码：A

文章编号：1001－1978（2015）08－1061－05

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．08．007