陈双璐，于 和

(天津市儿童医院，天津 300074)



陈双璐，于 和

(天津市儿童医院，天津 300074)

目的：建立反相高效液相色谱法同时测定清化丸中连翘酯苷A和绿原酸含量的方法。方法：色谱柱为Shim-pack VP-ODS C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈-0.2%磷酸(14∶86)；检测波长为330 nm；流速：1.0 ml/min。结果：连翘酯苷A在0.232～1.856 μg(r=0.999 9)范围内、绿原酸在0.25～2.00 μg(r=0.999 6)范围内与峰面积呈良好的线性关系，平均回收率分别为97.90%和98.89%；RSD分别为0.317%和0.685%(n=6)。结论：该方法简便，结果准确，重现性好，可作为该制剂的质量控制方法。

清化丸，RP-HPLC法，连翘酯苷A，绿原酸

清化丸是以本院老中医的经验处方为基础，经改良制备工艺后制成的医院制剂，由玄参、苦地丁、赤芍、天花粉、连翘、金银花等10多味中药组成，具有清热解毒、软坚消肿的功效，用于治疗急性淋巴腺炎、疮疖化脓性皮肤病。方中金银花的定量成分为绿原酸，其具有广泛的抗菌活性，有抗病毒、解热抗炎的作用[1，2]。连翘的定量成分是连翘酯苷A，其同样具有很强的抗菌及抗病毒活性[3，4]，临床上常用连翘治疗急性风热感冒、痈肿疮毒、淋巴结核等症。为很好的控制制剂的质量，笔者采用高效液相色谱(HPLC)法同时测定制剂中连翘酯苷A及绿原酸的含量，方法简单、快捷。

1 仪器与试药

1.1 仪器 LC-2010A高效液相色谱仪(日本岛津)，紫外检测器，LCsolution色谱工作站；双频恒温数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药 绿原酸对照品(中国食品药品检定研究院提供，批号110721-200613，供含量测定用)、连翘酯苷A对照品(中国食品药品检定研究院提供，批号111810-201103)，乙腈(色谱纯，天津市康科德科技有限公司)，磷酸(色谱纯，天津市科密欧化学试剂开发中心)，水为纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)，其余试剂均为分析纯。清化丸(本院自制，批号为20131201、20140301、20140401)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Shim-pack VP-ODS (150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.2%磷酸(14∶86)；检测波长为330 nm；柱温：40 ℃；流速：1.0 ml/min；进样量10 μl。

2.2 溶液的制备与系统适用性试验

2.2.1 混合对照品溶液的制备 精密称取绿原酸对照品1.25 mg，连翘酯苷A对照品1.16 mg，置10 ml量瓶中，加70%甲醇至刻度，制成每1 ml中含绿原酸125 μg、连翘酯苷A 116 μg的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取清化丸样品(20140401)剪碎，取约1 g，精密称定，放入具塞三角瓶中，精密加入70%甲醇30 ml，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 按处方配比，制备缺金银花与连翘的清化丸阴性样品，再按“2.2.2”项下制备方法，制得阴性对照液。

2.2.4 系统适用性试验 分别吸取供试品溶液、对照品溶液、阴性对照溶液，分别按照上述色谱条件进样，记录色谱图(见图1)。结果表明，供试品溶液与对照品溶液在相同保留时间处有连翘酯苷A与绿原酸色谱峰，而阴性对照溶液在该处未出现色谱峰，对测定无干扰。理论塔板数按连翘酯苷A峰与绿原酸峰计算均大于5 000；分离度符合要求。

1.绿原酸 2.连翘酯苷A

2.3 线性关系考查 分别精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液2.0、6.0、10.0、12.0、14.0和16.0 μl，依次注入高效液相色谱仪，按照上述色谱条件进样，测定连翘酯苷A峰与绿原酸峰面积。分别以各自的进样量X(μg)为横坐标，以峰面积Y为纵坐标，进行线性回归分析，得连翘酯苷A的回归方程为：Y=955 918.10X+24 664.71(r=0.999 9)，结果表明连翘酯苷A进样量在0.232～1.856 μg范围内与峰面积呈现良好的线性关系；得绿原酸的回归方程为：Y=1 518 040.57X+64 214.71(r=0.999 6)，结果表明绿原酸进样量在0.25～2.00 μg范围内与峰面积呈现良好的线性关系。

2.4 精密度试验 精密吸取上述混合对照品溶液适量，微孔滤膜过滤，取续滤液10 μl注入高效液相色谱仪，连续进样6次，按照上述色谱条件分析，测定峰面积，结果混合对照品溶液中连翘酯苷A平均峰面积为1 071 126.2，RSD为0.50%；绿原酸平均峰面积为1 966 308.3，RSD为0.25%，表明仪器精密度良好。

2.5 重复性试验 取同一批清化丸样品适量，平行6份，按照文中“2.2.2”项下方法制备供试品溶液并测定，计算样品含量。结果测得样品中连翘酯苷A平均含量为2.189 mg/g，RSD为0.45%；样品中绿原酸平均含量为1.644 mg/g，RSD为0.70%，表明方法的重复性良好。

2.6 稳定性试验 取同一批清化丸样品适量，制成供试品溶液，分别在0、2、4、6和8 h进样测定连翘酯苷A和绿原酸峰面积，结果连翘酯苷A平均峰面积为1 499 562.5(RSD为0.37%)，绿原酸平均峰面积为1 955 246.5(RSD为0.13%)，表明供试品溶液在8 h内稳定。

2.7 加样回收率试验 分别精密称取连翘酯苷A与绿原酸对照品适量，加70%甲醇制成浓度为0.121 2 mg/ml和0.098 8 mg/ml的混合对照品溶液；另取已知含量的清化丸适量，约0.5 g，精密称定，共6份，精密加入70%甲醇20 ml，再精密加入上述混合对照品溶液10 ml，称重，超声处理30 min，放置至室温，再称重，加入70%甲醇补足重量，按上述色谱条件测定，结果见表1。连翘酯苷A的平均加样回收率为97.90%(n=6)，RSD为0.317%；绿原酸的平均加样回收率为98.89%(n=6)，RSD为0.685%。

表1 连翘酯苷A和绿原酸加样回收试验结果

2.8 样品测定结果 取清化丸3批样品(批号为20131201、20140301、20140401)，按上述供试品溶液制备方法操作，按“2.1”项下色谱条件测定，进样10 μl，测得样品中连翘酯苷A含量分别为：2.346、2.480和2.189 mg/g；样品中绿原酸含量分别为：1.872、1.813和1.631 mg/g。

3 讨论

本文采用等度洗脱的HPLC法测定制剂中连翘酯苷A与绿原酸的含量，较之梯度洗脱法更简单方便，同时能准确地测定两种有效成分的含量。

选择提取溶剂时，比较了50%甲醇、70%甲醇和甲醇，结果用70%甲醇提取完全；本文比较了超声与加热回流两种提取方式，连翘酯苷A在高温条件下很不稳定，因此选择了超声提取方式。考查了不同超声提取时间，结果30 min与40 min含量一致，故定为30 min。

选择流动相时，比较了甲醇-磷酸溶液系统与乙腈-磷酸溶液系统，结果以乙腈-0.2磷酸溶液(14∶86)有效成分的分离效果最好，柱效最高，故选用此系统为测定的流动相。

1 唐敏,刘耀,王渝,等. 金银花总黄酮粗提物体外抑菌作用研究[J]. 中国药房，2008,19(30):2321-2323

2 潘瞾瞾,王雪峰,闫丽娟,等. 金银花提取物体外抗甲型流感病毒FM1株的研究[J]. 中国中医药信息杂志,2007,14(6):37-38

3 李仲兴,王秀华,赵建宏，等. 连翘对金黄色葡萄球菌及表皮葡萄球菌的体外抗菌活性研究[J]. 天津中医药,2007,24(4):328-330

4 王四旺,王剑波,王剑波，等. 连翘抗病毒的研究进展[J]. 中国医药导报,2010,7(2):9-10

Determination of forsythoside A ang chlorogenic acid in Qinghua pills by RP-HPLC

Chen Shuanglu ，Yu He

(Tianjin Children Hospital,Tianjin 300074)

Objective: To establish a method for the simultaneous determinationg of forsythoside A and chlorogenic acid in Qinghua pill. Methods: RP-HPLC method was used with Shim-pack VP-ODS C18column(150 mm×4.6 mm, 5 μm). The mobile phase was consisted of acetonitrile-0.2% phosphoric acid solution (14∶86). The flow rate was 1. 0 ml/min. The detection wawelength was at 330 nm. Results: The linear ranges of forsythoside A and chlorogenic acid were 0.232～1.856 μg (r=0.999 9) and 0.25～2.00 μg (r=0.999 6), respectively. The average recoveries were 97.90%(RSD was 0.317%)and 98.89%(RSD was 0.685%), respectively. Conclusion: The method is simple, practicable, accurate, which can be used for the quality control of Qinghua pills.

Qinghua pills,RP- HPLC, forsythoside A, chlorogenic acid

2014-07-01

R927.2

A

1006-5687(2015)01-0010-03